MicroRNA在急性心肌梗死中作用的研究进展

杨 洋,甘 宇,周建业,杨新卫

MicroRNA在急性心肌梗死中作用的研究进展

杨 洋1,甘 宇2,周建业2,杨新卫3

心肌梗死;冠心病;micro RNA;心肌氧需量

心肌梗死(myocardial infarction,MI)是一个具有高发病率与高死亡率的全球性疾病。冠心病(CHD)是急性心肌梗死的主要诱因。冠心病冠脉管腔狭窄到严重程度后,心肌氧需量(myocardial oxygen demand, MVO)与供氧量之间的尖锐矛盾,心肌细胞因缺氧导致不可逆性的损伤导致心肌梗死发生[1,2]。心肌梗死导致心肌细胞死亡,心肌细胞肥大、纤维化,并由此可引发心脏疤痕形成和左心室重构包括心脏扩张、收缩功能障碍。心肌组织缺氧所造成的内皮细胞凋亡、毛细血管密度不足进一步使心肌梗死面积扩大,并加重左室功能障碍[3]。而在这一系列变化中,MicroRNA (miRNA)起了重要的作用。

miRNA是一种内源性的小非编码RNA分子,与信使RNA通过碱基互补配对结合,调节其基因表达[4]。miRNA作为细胞内的RNA,调控转录后表达水平,并认为具有成为治疗学靶点的可能。众多心血管疾病发病机制研究如:血管形成、心肌细胞肥大、心力衰竭以及心肌纤维化等均涉及miRNA[5]。

心肌梗死后miRNA的异常表达的情况,miRNA和miRNA簇(miRNA cluster)、miRNA组合(miR Combo)以及胞外小囊泡(EVs)在心脏结构重塑和纤维化过程中所起的作用。

1 心肌梗死后miRNA的异常表达

心肌梗死情况下,部分循环miRNA表达异常已被发现。如:D’Alessandra、Long分别发现心肌梗死情况下循环miRNA中由心肌细胞衍生miRNA(miR-1, miR-133,miR-499,miR-208)水平升高,而冠脉疾病情况下内皮细胞相关miRNA(miR-126)水平下降[6,7]。miRNA在心脏疾病中的变化,已由Bronzeda-Rocha等总结发表,图表总结丰富[8]。

决定循环miRNA在正常生理情况下水平以及相应病理情况刺激下而产生变化的机制,目前可考虑5个方面:①细胞死亡后,因质膜破裂而释放;②细胞在受到应激刺激后释放;③调控miRNA合成和降解过程;④调控miRNA在体循环中的降解;⑤通过摄取循环中的miRNA达到细胞间通讯的作用[6]。如何通过研究心肌梗死后miRNA异常表达机制来探索心肌梗死有效治疗手段,是机制研究的主要目的。

早在2011年,Small和Olson就指出,对于细胞介导的疾病,希望通过细胞来探索治疗疾病途径是很困难的或者是根本行不通的;但肯定能制造出与miRNA有关的药品,因为从miRNA的调节机制出发,围绕心血管疾病的各个方面开展的治疗途径研究,将激发各种可能;治疗方法的研究方向可分为:通过抗miRNA(antimiRs)来抑制病态miRNA;通过miRNA的“拟态”(miRNA mimics)过表达来保护目标miRNA[9]。

1.1 miR-1miR-1是第一种被广泛发现并证实在心脏的生长和心脏疾病起到关键调节作用的miRNA,血浆miR-1水平与心肌梗死的急性心肌损伤密切相关,Pan等[10]实验证明miR-1抑制蛋白激酶Cε (PKCε)和热休克蛋白60(HSP60)这两种保护心肌缺血再灌注损伤以及抑制细胞凋亡的因素,从而提示miR-1与心肌梗死患者的心肌损伤水平一致,而LNA-antimiR-1则有效地抑制了小鼠的心肌缺血再灌注损伤。Huang等[11]实验发现miR-1通过增强细胞对氧化应激(oxidative stress)的抵抗,提高了移植入小鼠梗死后心肌的间质干细胞(MSCs)的存活率。

1.2 miR-133a Izarra等[12]发现miR-133a通过减少胱天蛋白酶3(caspase 3)活性以及通过靶向作用于凋亡前基因Bim、Bmf促进心肌祖细胞(CPCs)在氧化应激(oxidative stress)的情况下存活。而且,发现在急性心肌梗死的鼠类模型移植转染miR-133a心肌祖细胞(miR-133a-CPCs)后,通过减轻心肌肥大,心肌细胞的凋亡明显提高了心功能,并在体外研究中还可以提高碱性成纤维细胞生长因子(bFgf)、血管内皮生长因子(Vegf)、胰岛素样生长因子1(Igf1)表达。

1.3 miR-25 心肌梗死之后心力衰竭发生率很高。Ca2+所依赖的心肌肌质网Ca2+-ATP酶(SERCA2a)是心肌细胞兴奋-收缩偶联的首要机制。若SERCA2a活性的下降和表达的减少,将损害Ca2+摄入,这就是心力衰竭的标志[13]。Wahlquist等[14]发现,miR-25通过调节相关的mRNA所表达的蛋白来降低SERCA2a活性,从而促进心力衰竭和损害心功能。而抗miR-25可以阻止内源性miR-25病理性上调,并恢复SERCA2a活性,这也是首次证实抗miR-25能直接控制SERCA2a蛋白的水平,从而获得一个长期心脏功能改善过程。

1.4 miR-29b 人类左心室有20亿～40亿个心肌细胞,一次心肌梗死就可以在几小时之内将超过其中的25%破坏[15]。由于心肌细胞再生能力有限,所以多数死亡细胞的病灶70%由纤维组织、30%由梗死组织形成的疤痕替代[16]。心肌纤维化最终的结果就是心脏生理学形态的毁灭和心肌组织功能障碍;Thum等[17]发现在心肌梗死之后,miR-29被证实调控了包括胶原1型A1、胶原1型A2、胶原3型A1的几种胶原以及原纤蛋白1,调控的结果是促进了细胞外基质在心肌梗死后的沉积。Abonnenc等[18]进一步研究发现,miR-29b在心肌梗死后下调,而miR-29b和miR- 30c在成心肌细胞中含量丰富,并参与心肌纤维化。

1.5 miR-24 Fiedler等[3]发现在心肌缺血的条件下,高表达miR-24诱导了内皮细胞的凋亡,而miR-24反义寡核苷酸(antagomirs)则减少了内皮细胞的凋亡。通过阻断内源性miR-24可以弱化在缺氧条件下的内皮细胞的凋亡,并且报告了通过阻断miR-24增加了人脐静脉内皮细胞生成血管的能力。Meloni等[19]证实了这一点。而Qian等[20,21]报道Myh6促进miR-24表达可使心肌细胞在急性损伤后的存活明显改善。而且心肌过表达miR-24将减少心肌梗死后疤痕面积以及改善心功能。

1.6 miR-34 Bernardo等[22]发现通过阻断miR-34家族而不是单独阻断miR-34a,能够阻止心肌梗死导致的左心室重构和心房扩大,还发现通过阻断miR-34家族能改善小鼠由于慢性压力超负荷而导致的心脏病理性肥大和功能障碍。并认为阻断整个miR-34家族将有很高的治疗学潜力。Iekushi等[23]则认为骨髓衍生的单核细胞(BMCs)通过释放类胰岛素样生长因子-1(IGF-1),能够阻止miR-34a产生作用并阻断心肌细胞凋亡。Xu等[24]发现阻止miR-34a可以减少体外培养BMCs死亡,并在心肌梗死小鼠模型体内提高BMCs修复心脏功能的能力。Boon等[25]也证实阻止miR-34a能够减少心肌梗死时心肌细胞死亡和纤维化,从而改善心脏功能。Huang等[26]的研究证明miR-34a直接靶向作用于Smad4在心肌梗死后心肌纤维化进程中扮演了决定性角色,阻断miR-34a有希望成为治疗心肌纤维化的一种治疗策略。

1.7 miR-92a Hinkel等[27]通过结扎猪心脏前降支,建立了急性心肌梗死的动物模型,展示抑制miR-92a后所产生的多方向获益效果,比如促成缺血再灌注损伤后心功能重建;除此之外,抑制miR-92a后可以保护内皮细胞,保护冠脉系统或促其再生,抑制缺血后炎症反应以及直接保护心肌等,而这些功能在限制心肌梗死面积,恢复缺血区域的功能方面均有作用。

1.8 miR-99a Li等[28]实验发现通过在慢病毒介导miR-99a使缺血心肌组织中miR-99a高表达,使心肌梗死小鼠的心功能恢复,减少病理性的心肌细胞重建,其机制是miR-99a能够组织细胞凋亡和促进细胞自噬。这些发现提示miR-99a在心肌梗死后左心室重建过程中起到心脏保护的作用,所以认为提高miR-99a的表达有治疗局部缺血性心脏病的潜力。

1.9 miR-30 Shen等[29]第一次阐述miR-30家族能够直接调控胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)来调控硫化氢(H2S)的产生,而H2S是一种调节心血管功能的气体信号分子。miR-30家族的过表达将减少CSE的表达,减少H2S的产生,增加含氧量低的心肌细胞损伤。通过系统的引入(LNA)-miR-30家族抑制剂,使整个miR-30家族沉默,提高CSE和H2S的水平,保护缺氧细胞生存,缩小梗死面积,减少心肌梗死灶周围凋亡细胞的数量。Shen等[29]认为屏蔽miR-30家族是对于缺血性心肌病一种潜在的治疗方法。

2 miRNA在心肌梗死中的作用

以上是探讨了单种miRNA在心肌梗死中所起的作用。对于机体这个由多种细胞、组织、器官所组成的复杂系统,miRNA的调控不只是一对一那么简单, miRNA簇(miRNA cluster)、miRNA组合(miR combos)以及混合制剂(cocktail)概念的提出,对miRNA与急性心肌梗死作用机制的研究提供了新的参考方向。2 0 1 0年Zhang等[30]发现GATA-4调节miR-144/451簇在缺血再灌注损伤导致的细胞损伤的情况下具有心肌细胞保护作用。Hu等[31]通过运用miR-21,miR-24,miR-221所组成抗细胞凋亡混合制剂(cocktail),能够促进移植在梗阻心脏的干细胞衍生的心血管祖细胞成活。而Jayawardena等[32,33]认为由miRNA-1,133,208,499所组成的miRNA组合进入梗阻心肌后将导致直接在体内由非心源性肌细胞向心肌细胞转化。他们认为由miRNA介导的心肌重构(cardiac reprogramming)可以作为一种在心肌损伤后促进心肌再生的治疗手段。但是他们也发现miRNA组合可能只是对心肌重构有用,对于心肌细胞的凋亡则无效,同样miRNA组合并没有诱导新生儿心脏成纤维细胞的内皮细胞显型;miRNA组合处理过后小鼠心肌梗死周边区域血管密度将有增加,但是没有显著意义[33]。

机体心肌梗死的情况下发生miRNA改变是个复杂的过程,miRNA的调控与被调控也是个复杂的过程,miRNA组合的成分无论是以生物信息学为依据,还是依靠单个实验来获得,与完全重现心肌缺血的条件下miRNA组合所参与的调控与被调控的过程还有部分差距,所以对心肌梗死情况下缺血、缺氧刺激心肌细胞旁分泌的富含多种miRNA胞外小囊泡的研究,希望重现心肌梗死情况下miRNA自然组合的调控与被调控过程,成为研究方向之一。

心肌梗死或心绞痛的情况下,EVs将会显著增加[34]。损伤的心肌细胞能产生富含miR-1和miR-133a的EVs通过调节myotrophin与转化生长因子β (TGF-β)信号通路的mRNA诱导心肌肥大[34]。EVs根据起源、大小、形态、收集方法细分为不同的种类;其中的外泌体(exosome)非常独特。外泌体能够携带多种蛋白、脂类、核酸(包括DNA、mRNA、miRNA)在受体细胞间穿梭,起到细胞间通信作用,尤其是通过miRNA传输起到转录后抑制调控基因表达的作用;所以,通过传输miRNA和mRNA,外泌体在细胞间的基因交换中已经起到了决定性的作用[35,36]。外泌体基于干细胞的研究近来已公认具有刺激血管发生、细胞保护、调节炎症反应以及细胞凋亡等作用;Sahoo等[15]认为外泌体在心肌梗死后心脏修复过程中作用的认识,有助于对心肌梗死后心脏修复机制的了解[15]。Barile等[36]发现纯化由心脏祖细胞(CPCs)分泌的EVs注射入小鼠心脏梗死边缘,能减少心肌细胞凋亡,增加血管密度,减少疤痕形成,增多梗死边缘有活力组织,从而改善心功能。而同样途径注射纯化表皮纤维细胞分泌的胞外小囊泡则没有此项治疗获益。所以认为EVs是人类CPCs分泌的活性成分,因富含抗细胞凋亡和新生血管的miRNA,可以改善心肌梗死后的心功能。

机体作为一个整体,心肌梗死发生后,内环境将发生一系列变化,这些病理生理改变可能使循环miRNA的异常与心肌细胞实际情况产生偏差。目前,以小型动物作为实验对象,通过独立的实验去了解miRNA、miRNA组合、EVs在心肌梗死中所起的作用已取得很大进展,如再给予一定补充,相信结果将更好。

通过建立大型动物心肌梗死模型,借助左心辅助装置(LVAD)在心肌梗死情况下能够有效减少心肌细胞凋亡、改善心肌细胞收缩功能这一作用[37,38],成功模拟冠心病中心肌冬眠(myocardial hibernation)这部分心肌;使心肌细胞在接近正常的内环境下,经历正常,缺血、缺氧濒临死亡一系列刺激后,因机械卸负荷(mechanical unloading)而使心肌细胞做功、需氧减少,最终大量存活这一过程。在展示体内心肌细胞心肌梗死变化的同时,又使心肌细胞存活,不至由于心肌细胞死亡、破坏,保留异常的miRNA不被降解而能被检测。基于高通量测序技术,相信能在时间、空间上首次系统的、准确地把握缺血、缺氧条件下大型动物活体心肌细胞miRNA的变化,指导今后人类心肌梗死后miRNA研究方向。

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R5412.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.023

1672-1349(2015)06-0773-04

2015-02-08)

(本文编辑郭怀印)

心血管疾病国家重点实验室开放课题(No.2013-KF01)

1.山西医科大学(太原030001),E-mail:doctorganyu@126. com;2.中国医学科学院、北京协和医学院、国家心血管病中心、阜外心血管病医院、心血管疾病国家重点实验室;3.山西医科大学第一临床医学院