干细胞在肝脏疾病治疗中的临床应用及分子机制

周霞 韩英

干细胞在肝脏疾病治疗中的临床应用及分子机制

周霞 韩英

干细胞是指一群具有自我更新和多向分化潜能的细胞，是最有治疗潜力的细胞资源，已成为再生医学领域的研究热点。目前，已有多种干细胞用于肝脏疾病的治疗，能有效改善患者血清指标，减少并发症发生，并提高生活质量。这些干细胞在细胞来源、移植途径及治疗效果等多个方面各有特点，但其治疗肝脏疾病的机制尚不清楚。本文将对目前已用于肝病治疗的各种干细胞的临床应用以及可能的分子机制进展进行阐述。

干细胞； 肝病； 临床医学； 分子机制

干细胞是一类具有自我更新和分化为多种组织和器官能力的细胞。早在2005年有研究第一次报道干细胞移植用于治疗肝病患者，显示了干细胞治疗对于肝脏疾病的支持作用［1］。根据干细胞的不同性质和不同来源，目前临床上干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的方式分为6种：自体骨髓干细胞移植、自体外周血干细胞移植、自体造血干细胞移植、自体骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）移植、异基因脐血干细胞移植和异基因脐带MSC移植。本文将对这些干细胞在肝脏疾病方面的实验研究和临床研究以及分子机制进行阐述。

一、骨髓来源干细胞

骨髓干细胞通常是指来源于骨髓的单个核细胞，该群细胞为混合细胞群，主要包括MSC、造血干细胞和内皮祖细胞等。骨髓干细胞已被报道运用于多种疾病研究，如血液系统疾病、心血管再生［2］、骨骼肌损伤修复［3］以及神经再生［4］等。骨髓干细胞用于肝脏疾病的治疗主要包括乙肝相关肝硬化、酒精性肝病和急慢性肝功能衰竭。

为了明确骨髓干细胞治疗肝脏疾病的可行性，研究者进行了系列骨髓干细胞治疗动物肝脏疾病模型的临床前研究。将骨髓干细胞输入急性肝衰竭的小鼠体内后，细胞可迁移并滞留于损伤的肝脏，对肝脏起修复作用［5］。自体骨髓干细胞移植可以减轻肝切除和肝移植所造成的肝损伤，并且提高肝纤维化小鼠的生存率［6］。为了进一步确认干细胞对肝脏疾病的治疗作用，研究者通过荧光标记干细胞，并追踪和定位移植入动物体内的干细胞。其中有一项研究用绿色荧光蛋白（green fl uorescent protein，GFP）标记骨髓干细胞，并通过尾静脉注入四氯化碳肝损伤的小鼠体内，结果显示这些细胞定居在损伤肝脏内，并且转分化为可分泌白蛋白的有功能肝细胞样细胞［7］。这些临床前研究所取得的治疗效果为骨髓干细胞治疗肝病的临床应用提供了一定的理论和证据支持。

一项研究以9例肝硬化患者为研究对象，经外周静脉对患者进行骨髓干细胞移植治疗，术后患者的白蛋白等生化指标水平得到了显著改善［8］。对于失代偿期终末期肝病患者，肝移植是最理想的治疗手段。但由于肝源有限，不能满足患者的需求。有研究发现自体外周血干细胞移植可以促进肝脏再生，显著改善患者的临床病程。在30个月的随访中，没有出现明显的并发症，进一步证实这一治疗的安全性和有效性，提示自体外周血干细胞治疗可以成为肝移植前的过渡治疗手段［9］。但是，也有部分研究显示骨髓干细胞移植的治疗效果有限。Laurent等［10］将58例肝病患者随机分组分别接受标准治疗、联合集落刺激因子和骨髓单个核细胞移植治疗。结果发现：与标准治疗组相比，干细胞治疗并没有显著改善患者的肝功能。因此，还需要更进一步的研究，为骨髓干细胞治疗肝病的临床应用提供依据。

二、外周血干细胞

外周血干细胞是来源于外周血的一群单个核细胞，主要是将骨髓中的干细胞用集落刺激因子动员到外周血循环中，再通过专用的单个核细胞分离机从外周血中富集、分离富含造血干细胞的单个核细胞。这群细胞可以分化为血细胞、内皮细胞、骨细胞、神经细胞和肝细胞等，促进损伤组织的修复和再生，目前已被报道用于治疗急性白血病、多发性硬化症［11］和肺部疾病［12］。

本课题组在国际上首次证实失代偿肝硬化患者的外周血干细胞在体内外均可被诱导分化为肝细胞样细胞［13］。随后，本研究用集落刺激因子连续3 ～ 5 d对肝硬化患者进行动员，收集分离外周血干细胞，用PKH26-GL（红色荧光）进行标记，经尾静脉输入裸鼠体内，结果显示这些移植的细胞迁移至裸鼠的肝脏并表达肝细胞表面标志［14］。进一步，从小鼠外周血干细胞中富集CD14+单核细胞，经肝动脉输入到肝硬化模型小鼠体内，发现其能显著改善小鼠血清生化指标并降低门静脉压力［15］。这些临床前研究提示自体外周血干细胞移植可以为失代偿肝硬化患者提供一种新的替代治疗方式。

基于动物实验的发现，本研究小组进一步开展了外周血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的临床研究。将40例患者（男31例和女9例）随机分为2组：一组在接受4 d集落刺激因子动员后，收集外周血干细胞后进行移植治疗；而对照组只接受集落刺激因子动员。比较治疗6个月以后两组患者的肝功能改善情况。发现与对照组相比，干细胞移植组患者的白蛋白水平上升，CTP评分下降，并且没有发现明显的副作用［16］。

和其他类型的干细胞相比，外周血干细胞有其独特的优势。它的分离创伤性更小且无需麻醉。另外，自体外周血干细胞移植很好的避免了免疫排斥及伦理学问题［17-18］。

三、造血干细胞

造血干细胞是骨髓干细胞的主要组成部分，能够自我更新和分化为其他祖细胞，或者形成集落单元。CD34是人造血干细胞的主要标志，也有少部分造血干细胞不表达CD34但表达另一标志分子CD133。造血干细胞的获得需要采集骨髓血或借助分离机，然后在干细胞实验室内进行造血干细胞的分离与扩增。通常借助CD34或CD133抗体和免疫磁珠从骨髓血中分离造血干细胞，也可借助流式细胞仪分选CD34或CD133阳性的造血干细胞，之后在体外对造血干细胞进行适当的扩增，再收集细胞进行移植［19-20］。

肝硬化是指进展性肝纤维化的晚期，伴有肝组织结构的破坏和假小叶的形成。原位肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效手段，但是其临床应用受到很多限制。因此，研究治疗肝硬化新的治疗方法十分必要。目前，最有研究前景的领域就是再生医学，尤其是干细胞治疗。大量的动物研究表明造血干细胞具有减轻肝脏损伤和促进肝脏再生的能力［21-23］。

在临床研究中，Gordon等［24］从自体外周血动员得到的1 × 106～ 2 × 108CD34+造血干细胞输入5例慢性肝病患者体内。其中3例是在CT引导下经门静脉输入，另2例经肝动脉输入。结果显示：干细胞移植后，患者的肝功能得到了显著改善，并且没有出现明显的并发症。另一项研究对经门静脉输入CD133+造血干细胞治疗的6例终末期肝病患者进行了6个月和24个月的跟踪观察。结果显示：尽管细胞移植没有明显改善肝功能的指标，但也没有并发症的报道［25］。提示造血干细胞移植治疗是安全可行的。但是，也有研究报道肝硬化患者经肝动脉移植骨髓来源的造血干细胞以后，1例患者出现了肝功能指标的恶化，另1例则出现肾病症状，并发展为1型肝肾综合征，最终死于肝功衰竭［26］。这意味着对失代偿期肝硬化患者，经肝动脉进行造血干细胞移植的安全性问题还需要进一步的研究和探索。

四、骨髓MSC

MSC是具有可塑性和多向分化潜能的一群细胞，来源于间充质和其他相关组织。这些细胞可与多种免疫细胞相互作用进而发挥其免疫调节作用［27］。Friedenstein等［28］第一次报道了分离和培养MSC的方法以及检测其分化能力。MSC不仅大量存在于骨髓中，其他组织如脂肪组织、骨骼肌和骨膜等也有此类细胞的存在。国际细胞治疗学会MSC委员会定义了MSC的特征：（1）具有贴壁生长的特性；（2）表达CD105、CD73和CD90，不表达CD34、CD45、CD14或CD11b，CD79a或CD19和HLA-DR；（3）体外具有成骨、成脂、成软骨的分化特性［29］。

MSC具有分化为肝细胞样细胞的能力为肝病的治疗提供了新的思路。在临床前研究中，将骨髓MSC经尾静脉移植入肝硬化模型鼠体内，发现小鼠的肝功能生化指标显著改善［30］。而对于原发性胆汁性肝硬化的小鼠，骨髓MSC移植可以调节全身免疫反应，促进肝脏炎症的好转［31］。

在临床实验中，Peng等［32］研究527例肝功能衰竭患者接受相同的常规治疗，其中53例患者在早期常规治疗基础上辅以骨髓MSC移植治疗。结果发现经MSC治疗的患者一定程度上缓解了肝脏损伤。虽然长期疗效没有显著的差异，但是干细胞移植治疗在改善肝硬化，减少肝癌的发生率和死亡率方面具有很大的潜力。另一项研究发现终末期肝病患者在进行骨髓MSC移植治疗后，其不仅能耐受治疗，而且肝脏功能也得到了显著改善［33］。一项关于骨髓MSC治疗肝功能衰竭的试验研究也证实干细胞移植可以改善患者的肝脏功能，提高患者的生活质量［34］。

尽管临床研究的结果为MSC的应用提供了良好的证据，但也确实存在一些不足。首先，干细胞的准备时间较长会使一部分患者错失治疗时机；其次，移植后体内的显踪和定位还需要更多的研究。第三，有一部分研究存在小样本、无对照、缺乏长期疗效、安全和预后的观察等不足之处，需要进一步完善［35］。

五、脐带MSC

MSC主要来源于骨髓，但其数量是有限，并且随着年龄和增殖代数的增长细胞数目不断减少［36］。而脐带MSC以易获得、来源广等特点备受研究者青睐。脐带取自健康足月胎儿，在取得父母授权同意后获得，采用机械加酶学消化的方法将脐带分离成单个细胞。对脐带细胞进行贴壁培养，在培养过程中添加MSC生长因子，并通过流式细胞仪监测MSC表型CD34-CD45-CD105+［37］。

Tsai等［38］将脐带MSC直接输入肝硬化大鼠肝脏内，发现大鼠的肝脏炎症明显减轻，肝脏功能改善并促进肝脏再生。本课题组首次证实特异的一组microRNA可以诱导MSC分化为肝细胞样细胞，并且这些肝细胞样细胞可以减轻裸鼠急性肝损伤，促进肝脏功能恢复［39-40］。

有研究报道45例慢性乙型肝炎肝硬化的患者，30例患者经门静脉移植脐带MSC治疗，而对照组15例患者则接受生理盐水治疗。在一年的观察期内发现：与对照组相比，干细胞治疗组的患者腹水显著减轻，肝功能明显改善［37］。这为脐带MSC的临床应用提供了重要依据。在脐带MSC治疗自身免疫性疾病方面也取得了显著疗效。已经应用于治疗系统性红斑狼疮［41］、免疫性血小板减少症［42］和风湿性关节炎［43］等的临床探索治疗。对于应用熊去氧胆酸治疗效果不好的原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis， PBC）患者，每4周输入1次脐带MSC，共3次，并继续给与熊去氧胆酸治疗。患者的乏力症状明显减轻，瘙痒症状也得到缓解［44］。此外，脐带MSC还可用于改善慢加急肝功功能衰竭患者的生存期、MELD评分等［45］。

六、脐血干细胞

脐血干细胞的获得是选择健康产妇，并经产妇知情同意，同时排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒及其他传染性疾病，无病理妊娠等。在胎儿娩出断脐后，消毒采血部位，应用装有血液保存液Ⅱ的一次性采血袋以封闭式采血法采血，每袋采脐血100 ml。在干细胞实验室内，用负收集法分离提取脐带血干细胞。脐血MSC具有容易获得，污染概率小和低免疫原性的特点［46］。脐血干细胞主要是CD271、CD29、CD90、CD105和CD73阳性的MSC，当然也存在CD34+细胞，其数量甚至有可能超过骨髓或者外周血的量。这些CD34+细胞可依靠抗体或者磁珠从脐血中获得［47］。

脐血MSC已经被报道用于治疗神经胶质瘤［46］、脊髓损伤［48］和肺部疾病［49］等。它们不仅可以缓解心肌梗死［50］、脑缺血［51］的症状，还可以促进伤口修复愈合［52］。最近的一项研究发现脐血MSC过表达肝细胞生长因子可在体外实现肝细胞样细胞分化。当干细胞移植入肝硬化大鼠体内后，大鼠的肝功能指标，甚至是组织学都得到了显著改善［53］。也有研究报导脐血MSC在趋化因子的作用下迁移到损伤的肝脏内，可能通过分化为肝细胞样细胞发挥其修复再生的功能［22］。而将脐血干细胞包裹在微胶囊中输入急性肝衰竭的小鼠体内则可以进一步降低发生免疫排斥的风险［47］。尽管脐血干细胞免疫原性较低，但使用未处理的细胞仍存在风险。

关于脐血干细胞的动物实验结果比较理想，但是鲜有临床研究的报道。因此，相比其他干细胞，脐血干细胞的临床应用还需要付出更多的努力。

七、干细胞治疗的分子机制

肝移植是治疗终末期肝病的理想手段。但是，由于供体缺乏、费用昂贵和不可预知的并发症限制了肝移植的临床应用。细胞治疗，尤其是干细胞治疗，通过自我更新、多向分化、旁分泌以及与免疫细胞相互作用等方式成为治疗肝脏疾病的新方式。回顾先前的研究，发现这些干细胞或直接移植入患者体内或者在体外诱导分化为肝细胞样细胞后进行移植治疗。但是，无论是干细胞还是肝细胞样细胞，它们在进入体内之后的命运并不清楚，是细胞融合、干细胞转分化和微环境中免疫调节，笔者将对这几种可能机制进行综述。

1. 细胞融合：细胞融合在生命之初就已经存在。而早在数十年前，就已经报道细胞融合和干细胞密切相关［54］。近来，很多研究已经在体内和体外成功实现干细胞诱导分化为肝细胞样细胞，而细胞融合则被认为是这个细胞命运转变的可能机制。

在高酪氨酸引起的肝衰模型中，延胡索酰乙酰乙酸盐水解酶基因（fumarylacetoacetate hydrolase gene， Fah）突变的小鼠在移植Fah+/+的骨髓干细胞后可以重新恢复其正常肝脏功能，并且形成表达Fah的再生小结。这些肝再生小结不仅表达本身的突变基因，也表达来自移植的野生基因型Fah，这与宿主基因和供体基因相互融合形成的多倍体基因组相一致［55］。Wang等［56］进行了一系列骨髓来源的肝细胞样细胞的移植研究，并通过Southern印迹杂交技术分析，发现这些定居肝脏的移植细胞是不同于供体细胞的杂合子。细胞遗传学进一步分析表明：将雌性小鼠肝细胞移植到雄鼠受者得到的是（80，XXXY）和（120，XXXXYY）肝细胞核型，这提示供体和宿主细胞之间的发生融合。另有研究表明，单独移植造血干细胞可同时提供血细胞和肝细胞，即通过Cre/lox进行DNA重组发现成熟的髓细胞和肝细胞发生自发融合，这意味着这些类似骨髓细胞的融合细胞可为多种组织的细胞疗法提供新的策略［57］。骨髓单核细胞，例如巨噬细胞可以通过体内融合产生功能型内皮细胞，为器官再生提供细胞治疗的新方法［58］。此外，脐带干细胞已经被报道可以通过细胞融合产生新的肝细胞样细胞［59］。但是，也有研究提示在不同的微环境中，干细胞也可以不通过细胞融合而产生功能性肝细胞样细胞［60］。

目前，大部分的研究显示了干细胞融合在肝脏疾病治疗中的积极作用。但是上述动物模型的应用性仍有待确定。而在Fah突变模型和酪氨酸血症中发现了细胞遗传学异常，包括异常核分裂和多核化，因此选择遗传学稳定的动物模型十分必要［61-62］。

2.转分化：转分化可能是干细胞治疗肝脏疾病最简单、最直接和最容易被接受的机制。而这种分化能力来自干细胞的可塑性，一种可以分化为不同胚层细胞的能力［63］。细胞融合曾被认为是干细胞治疗的主要机制，但研究发现脐带干细胞可以不经过融合而发生肝细胞转化［64］。目前，有大量的研究都显示了不同种干细胞都拥有分化为肝细胞样细胞的能力。Lagasse等［65］第一次报道了造血干细胞在体内可以诱导分化为肝细胞样细胞。人骨髓MSC可以在肝损伤小鼠体内分化为肝细胞样细胞［66］。脐血干细胞也可以分化为肝细胞样细胞，进而减轻肝脏损伤［67］。本课题组则首次证明乙肝肝硬化患者的外周血单核细胞可转分化为肝细胞样细胞。诱导干细胞的转分化最常用的方法是两步法，主要是在诱导培养基中加入多种生长因子（内皮生长因子，肝细胞生长因子等）、烟碱、抑瘤素、地塞米松等预先混合成分［68］。也有研究通过转录因子的组合（如Hnf4alpha， Foxa1， Foxa2 or Foxa3）实现肝细胞样细胞转分化。而本课题组利用一组七种microRNAs （mir-122， mor-1290， mir-148a， mir-424，mir-542-5p， mir-1246和mir-30a）成功实现了脐带MSC体外诱导分化为肝细胞样细胞，并将其移植入肝损伤裸鼠体内，发现裸鼠的肝损伤明显减轻，白蛋白水平上升及转氨酶的降低［40］。不管是在体内还是体外诱导干细胞转分化肝细胞样细胞，这些细胞真正具有肝细胞的功能，才是细胞治疗肝脏疾病的关键。

3. 免疫调节：肝脏是富含免疫细胞的特殊器官。这些免疫细胞与肝脏免疫耐受、接受新移植物和肝脏病毒持久存在密切相关。枯否细胞是定植在肝脏的特殊巨噬细胞，占肝脏非实质细胞的35%，这群细胞与肝脏损伤和肝脏再生息息相关。根据功能和表型的不同，枯否细胞可分为促炎的M1型和抗炎的M2型，这两种细胞在肝脏疾病的进程中发挥着不同的作用。研究发现人MSC可以改变枯否细胞的表型，从M1型变为M2型［69］。淋巴细胞主要包括T细胞、B细胞和NK细胞等，参与肝脏的免疫反应。在笔者课题组的研究中，发现乙肝肝硬化患者的血清IL-17水平显著高于正常人群。但在自体干细胞移植治疗以后，IL-17的水平显著降低。另外，外源性IL-17处理可以恶化肝损伤小鼠的肝脏功能，而给予IL-17抗体处理则促进肝脏功能改善。这些结果提示干细胞可能通过下调IL-17水平而发挥其对肝病的修复作用［70］。

干细胞，尤其是MSC，具有低免疫原性，很少表达HLA-1分子，不表达HLA-DR。共刺激因子CD40，CD80和CD86的表达缺乏，使MSC表现为免疫耐受状态［71］。干细胞在治疗肝脏疾病时还可抑制免疫细胞的增殖和成熟。干细胞可在其趋化受体的作用下迁移到损伤的肝脏，进而分泌增殖或抗凋亡细胞因子，促进肝细胞增殖。在生长因子的作用下，干细胞促进肝脏再生和损伤的修复［72］。细胞外基质的合成与降解失衡会导致肝硬化，这与肝星状细胞关系密切。而干细胞移植治疗可通过调节TGF-α和TGF-β抑制肝星状细胞的活化，抑制肝硬化进展［73］。另外，干细胞调节枯否细胞表型转变，改善肝损伤和肝硬化。MSC移植治疗则可显著改善对传统治疗无效的PBC患者症状［44］。在动物实验中，干细胞治疗PBC小鼠后，发现血清 TGF-β1和IFN-γ显著改变，从而调节肝脏炎症，促进肝脏损伤的缓解［74］。

尽管以往的这些研究结果显示了干细胞治疗肝病的巨大潜力，但是，其机制的明确还需要更多的深入研究。在基础研究领域，还需要对不同类型及不同来源的干细胞对不同肝脏疾病模型动物进行干预研究，明确不同干细胞的干预效果及其机制，为人类干细胞治疗肝脏疾病提供实验依据。

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Clinical application and molecular mechanisms of stem cell therapy for liver disease

ZhouXia, Han Ying. Xijing Hospital of Digestive Diseases, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China

Han Ying, Email:hanying@fmmu.edu.cn

Stem cells （SCs） are cells that can renew themselves and transform into the specialized cell types of tissues or organs， including hepatocyte-like cells. They provide promising potential therapy for patients with liver disease， including the improvement of serum parameters， the recovery of hepatic function， and even the improvement of quality of life， with few adverse effects. Recently， different stem cells have been used for liver disease therapy. These stem cells differ in cell sources， transplantation routes， and treatment effects. Moreover，the mechanisms of stem cell therapy for liver diseases are still not clear. Thus， we will review the clinical application and molecular mechanisms of stem cell therapy， in order to figure out the optimal treatment for liver diseases.

Stem cell； liver diseases； clinical medicine； molecular mechanism

2014-10-08）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.02.012

71003 西安，第四军医大学西京医院消化病医院

韩英，Email：hanying@fmmu.edu.cn