血管平滑肌细胞表型转化的影响因素及相关血管疾病
2015-01-22孟立平郭航远
孟立平 郭航远 季 政
作者单位:325000温州,温州医科大学第一临床医学院(孟立平、郭航远);浙江大学绍兴医院 绍兴市人民医院心内科(郭航远、季政)
在不同的外界因素影响下,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)具有不同的细胞表型,具有极强的可塑性。正常血管中膜中的VSMCs是一种高分化的细胞,主要起维持血管形态以及收缩血管的作用,具有低增殖、低迁移、低蛋白分泌的特征;当发生动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)等血管病变时,VSMCs可以去分化成为未分化的细胞,细胞收缩性能下降,表现出高增殖、高迁移、高蛋白分泌等特征[1]。以往把VSMCs细胞表型单纯的分为“收缩型”和“分泌型”[2],现在大量研究已证实,VSMCs可从已经分化的“收缩”表型向“分泌”表型方向去分化。在不同的外界因素作用下,VSMCs去分化的程度不同,可表现出各种介于“收缩”型与“分泌”型之间的细胞表型特征,从而在多种血管病变的发生发展中发挥重要作用[3]。本文主要阐述近年来有关VSMCs表型转化影响因素的研究进展以及VSMCs与常见血管疾病之间的关系。
1 VSMCs不同细胞表型的特征及标志物
分化成熟的“收缩”型VSMCs在机体中主要起维持血管形态的作用,通过收缩和舒张来调节血流量稳定,分泌极少量细胞外基质,在透射电镜下肌丝均匀分布,与蛋白质合成密切相关的核糖体、内质网、高尔基复合体等细胞器结构相对较少。去分化的“分泌”型VSMCs通过迁移和增殖以及分泌大量细胞外基质,在多种血管疾病的发生发展中扮演着重要角色。在透射电镜下观察“分泌”型VSMCs,胞质中肌丝明显减少,内质网、高尔基复合体明显增多。
自1979年Chamley等第一次发现VSMCs具有不同的细胞表型以来,已发现一大批特异度比较高的可以作为已分化成熟VSMCs标志的蛋白,例如与细胞收缩密切相关的SMαactin、calponin、SM-MHC、SM22α、smoothelin 等以及参与细胞骨架构成的 h-caldesmon、β-vinculin、telokin、metavinculin、desmin等[4]。这些蛋白在分化成熟的VSMCs中表达,其表达量随着VSMCs的去分化而逐渐减少;相反,最近研究发现骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和糖基质蛋白在去分化的VSMCs中开始表达,并且表达量与细胞的去分化程度相关[5]。 通过检测 SMα-actin、SM-MHC、calponin、OPN 等蛋白的表达情况以及电镜下观察细胞的超微结构特征是近年来国内外研究者常用的鉴别VSMCs不同细胞表型的方法[6-7]。VSMCs表型转化是一个连续过程,迄今尚未发现单个标志基因能完全确定VSMCs的表型状态。因此,综合应用几个关键的标志指标进行表型鉴定可能会更客观。
2 VSMCs表型转化的影响因素
机体中VSMCs的表型转化往往受到一系列复杂的信号分子和环境因素整合效应的影响,现已明确的影响因素主要包括外界的机械力、细胞外环境中的细胞因子、细胞与细胞之间的相互作用以及细胞内部环境的改变。
2.1 促使VSMCs去分化的因素
血小板源性生长因子B(platelet derived growth factor-B,PDGF-BB)是最早发现的一种可以促进VSMCs表型转化的因素,它是一种较强的促有丝分裂因子,具有促增殖和迁移的生物活性,又能使VSMCs的合成及分泌功能增强。PDGFBB可以诱导特定DNA的表达或沉默,从而刺激 VSMCs表型转化和增殖。分化成熟的VSMCs合成和分泌PDGF-BB的能力弱。PDGF-BB主要通过MEK1/ERK和MKK6/p38MAPK两条途径发挥促VSMCs去分化的作用。低剂量的PDGF-BB(20 ng/ml)也是目前离体实验中制作VSMCs去分化细胞模型的常用药物[8]。
血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)具有诱导VSMCs增殖和迁移的作用,可减少VSMCs中SM-α-actin、SM-22等收缩性蛋白的表达[7],增加OPN的表达。方立等[7]的实验结果显示,与对照组比较,AngⅡ(10-6mmol/L)组VSMCs中p38、JNK、ERK、P65 活化增加,原癌基因 c-myc、c-fos表达增加,AngⅡ可能正是通过激活原癌基因c-myc和c-fos,通过p38、JNK、ERK、P65通路而发挥去分化VSMCs的作用。
除PDGF-BB和AngⅡ以外,bFGF、EGF也是被广泛认可的具有诱导成熟VSMCs去分化作用的因素。最新研究显示,基质金属蛋白酶 1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)作为一种细胞外基质降解酶,还可以通过激活蛋白酶活化受体1(protease-activated receptor-1,PAR-1),促进 ERK 磷酸化,最终导致VSMCs收缩型蛋白表达减少,分化成熟的VSMCs向未分化的VSMCs转化[9]。我们的前期研究发现,同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)具有促进VSMCs增殖和迁移的能力[10],在此基础上,我们通过检测 SM-actin、SM-MCH、calponin、OPN等蛋白的表达量,发现Hcy组中 SM-MHC和calponin的表达量降低,OPN的表达量升高,进而推测Hcy也具有促进VSMCs去分化的作用,这种作用可能也是Hcy促进VSMCs增殖和迁移的一种重要机制。
2.2 促使VSMCs分化的因素
胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是目前研究最为深入的一种具有抑制VSMCs表型转化作用的因素。IGF-1主要通过与胰岛素样生长因子受体结合,激活下游的PI3K-AKT通路,从而增加VSMCs收缩型蛋白的表达,Martin等[11]的实验结果显示,在胰岛素样受体底物被抑制或降解时,IGF-1不能发挥促进VSMCs分化的作用,同样的,抑制下游PI3K-AKT通路后IGF-1的作用也被抑制。但值得注意地是,在离体细胞实验中,培养基中加入IGF-1后,虽然细胞形态变细长、SM-actin、SM-MHC等收缩性蛋白表达增多这些均与VSMCs分化成熟的特点相符,但IGF-1却可以增加VSMCs的增殖,与分化成熟的VSMCs特征不符,这也表明VSMCs的分化与去分化是一个受多种因素调控的复杂过程,在这一过程中可以出现多种细胞表型,而不仅仅是传统观点所认为的在“收缩型”和“分泌型”二者之间转化。
转化生长因子 β(transforming growth factor-β,TGF-β)是目前研究最热门的具有抑制VSMCs表型转化作用的因素之一。体内外研究均表明,TGF-β对于VSMCs的分化和功能具有重要作用。目前已经证实在人、大鼠原代主动脉平滑肌细胞及大鼠主动脉平滑肌细胞系A10中,TGF-β可促进平滑肌标志分子 SMA、SM22α、SM-MHC、calponin的表达,从而发挥促进或维持平滑肌细胞分化状态的作用。TGF-β可以活化 p38、ERK、JNK、PI3K/Akt等信号,其中 PI3K/Akt信号在TGF-β诱导的平滑肌细胞分化中起主要作用。最近一项研究显示,TGF-β可以抑制由 PDGF-BB引起的 VSMCs中MMP-2的表达,从而减少细胞外基质的分泌,维持VSMCs的分化状态[12]。与IGF-1相似的是,TGF-β在促进VSMCs分化的同时也会促进 VSMCs增殖[13],而 Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)可以抑制 TGF-β 的这种作用,促进平滑肌细胞去分化。
雷帕霉素通过与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(mammalian target of rapamycin complex,mTORC)结合,抑制下游S6K1的磷酸化,从而发挥一系列相关作用。在Martin等[2]的实验中,雷帕霉素组VSMCs较Control组磷酸化的S6K1表达减少,SM-MHC、SM-22等收缩性蛋白表达增多;加入雷帕霉素,再通过基因转染的方法增强S6K1的表达,雷帕霉素诱导VSMCs分化成熟的作用则被抑制;如果抑制S6K1的基因表达,VSMCs中收缩性蛋白表达增加,分化增加,以上均表明雷帕霉素通过抑制mTORC/S6K1通路发挥促进VSMCs分化的作用。
在后续实验中,进一步探明了VSMCs去分化的一条信号通路:Rheb法尼基化/mTORC/S6K1/丝氨酸磷酸化/降解胰岛素底物受体/抑制PI3K、AKT通路,在这一信号通路传导过程中,他汀类药物可以通过抑制部分Rheb法尼基化,从而减弱此信号通路的传导,最终促进VSMCs的分化成熟,这可能也是他汀除了降脂作用之外发挥抗AS的另一种机制[6]。
早期实验发现,与内皮细胞共培养的VSMCs中SM-actin的表达量增多,细胞分化水平更高。之后Brown等[14]的研究发现,内皮细胞向培养液中分泌了某些成分,这些成分通过激活PI3K/AKT通路从而促使VSMCs的分化成熟。Fetalvero等[15]的实验进一步证实,内皮细胞分泌的前列环素通过与前列环素受体结合,激活下游的PKA/cAMP通路,从而发挥促VSMCs分化成熟的作用。方立等[7]的研究则证实,内皮祖细胞培养液也具有促进VSMCs分化成熟的作用,并且强于内皮细胞培养液。他们在后续实验中还发现内皮祖细胞是通过分泌降钙素基因相关肽,抑制MAPK通路,减少p38、JNK1/2、ERK1/2这些蛋白的磷酸化,抑制 c-myc、cfos增殖相关基因的表达,从而发挥抗AngⅡ诱导的VSMCs去分化作用[16]。
微小 RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类进化上高度保守的非编码小分子单链RNA,通过降解mRNA或抑制基因翻译,在翻译水平调控基因表达。越来越多的证据显示,miRNAs参与了对细胞增殖、迁移和凋亡的调控[17]。目前已被证实的与VSMCs表型转化相关的miRNAs主要包括:miR-221、miR-222、miR-21、miR-146a、miR-133、miR-143 和 miR-145[8]。在大鼠的VSMCs离体实验中,miR-143和miR-145表达量较高,在细胞中加入PDGF-BB后,这两种miRNA表达量骤减。但通过基因敲除的手段敲除小鼠miR-143或miR-145基因后,小鼠的VSMCs中SM-actin等收缩性蛋白表达并未明显减少[18],表明 miR-143和 miR-145在正常的VSMCs分化过程中并未发挥作用。但用球囊损伤血管后,miR-143和miR-145基因敲除的小鼠VSMCs分化受阻,表明这些miRNAs主要在血管损伤后的修复过程中发挥作用。Cheng等[19]的实验进一步证实,过表达miR-145的小鼠通过抑制转录因子KLF5,从而减少球囊损伤后VSMCs的增殖和迁移。最近Zhao等[20]的研究从细胞和动物两个层面证实,miR-145通过抑制TGF-βⅡ受体,减少TGF-β诱导的细胞外基质分泌,从而促进VSMCs分化。以miRNAs为切入点来调控VSMCs的表型转化,从而达到相关疾病的预防和治疗目的是现代生物医学的热门领域。
以上所有影响VSMCs分化与去分化的因素最终都通过细胞内信号通路的传导而影响VSMCs中特定基因的转录和表达。表观遗传在VSMCs的表型转化中起了决定性的作用。表观遗传调控通过对细胞染色体中结构的修饰,影响转录因子与DNA的结合,最终导致特定基因转录区的表达或沉默[1],导致VSMCs表现出具有不同特征的细胞表型。
3 VSMCs表型转化与相关血管疾病
VSMCs的表型转化参与了血管重构等病理过程。目前已证实,VSMCs的表型转化在AS和高血压等疾病的发生发展中扮演着重要角色,同时还参与了某些癌症、膀胱梗阻性疾病、消化系统以及生殖系统疾病的进程[3,5]。AS是第一个被发现的与VSMCs表型转化相关的疾病,也是目前有关VSMCs表型转化与疾病之间关系研究最为深入的一个疾病。而动脉瘤是最近才刚发现的有VSMCs表型转化参与的血管疾病。
3.1 VSMCs表型转化与AS的关系
过去大量实验研究表明,从人体动脉硬化大斑块下方提取的VSMCs与正常血管VSMCs相比,SM-actin、SM-MHC等收缩性蛋白表达减少,Wagner等[6]的实验进一步证实了粥样硬化斑块中mTORC1活性提高,磷酸化S6K1表达增加。Sartore等[21]通过将猪的股动脉浸泡在血清中,用球囊扩张血管来制作血管损伤和新生血管的体外模型,发现与无球囊损伤的对照组比较,损伤组中VSMCs中SM-actin等收缩型蛋白减少,OPN等未分化表型的标志蛋白表达增多,mTORC1活性增加,磷酸化S6K1表达增多,表明VSMCs的表型转化参与了动脉血管损伤后血管重建的过程。但是有关粥样硬化斑块中发生表型转化的VSMCs来源的问题目前还存在较大争议。传统观点认为,粥样斑块中的VSMCs是由动脉中膜中的VSMCs迁移而来,但到目前为止尚无明确的直接证据来证实这一观点。最近Schwartz等[22]通过对血管斑块部分超微结构的研究证实,斑块中具有VSMCs形状的细胞出现在由动脉中膜向斑块迁移的过程中,间接支持了斑块中VSMCs来源于动脉中膜的观点。不过也有观点认为,斑块中发生表型转化的VSMCs其实是由骨髓来源的造血干细胞进入斑块后分化而成,Iwata等[23]通过实验证实,斑块中SMα-actin阳性的细胞来源于血液中的造血干细胞,表明在AS形成过程中,并不是所有的VSMCs都来源于血管中膜。但是由于不仅仅只有VSMCs表达SMα-actin,内皮细胞、肌成纤维细胞以及活化了的巨噬细胞都可以表达SMαactin,所以上述实验中发现的斑块中的造血干细胞来源的表达SMα-actin的细胞并不能确定一定是VSMCs。限于目前尚未发现一种VSMCs特异性表达的蛋白可以用来鉴定VSMCs,所以到现在为止我们还是无法完全明确斑块中发生表型转化的VSMCs来源。
3.2 VSMCs表型转化与动脉瘤的关系
Schwartz等[22]通过结扎小鼠胸主动脉两端,将血管两端搭桥相通,向两端结扎的胸主动脉内注入蛋白酶或生理盐水来制作小鼠在体动脉瘤模型和相应的对照模型,分别在第1、3、7、14 天后切片观察动脉轮廓,PCR 检测 SM-actin、SM-22及MMP-2的表达,免疫组化检测caspase-3的表达,实验结果显示蛋白酶组在14 d左右出现明显的动脉瘤,7 d时蛋白酶组比生理盐水组中SM-actin、SM-22表达量降低,MMP-2表达量升高,两组之间caspase-3的表达情况无显著差异。这一实验结果证实了VSMCs表型转换与动脉瘤之间的关系,但遗憾的是,我们并不能从这一实验结果推测出VSMCs表型转化与动脉瘤之间的因果关系。要想证明二者之间的因果关系,可以借鉴研究VSMCs表型转化与AS之间关系的方法,采用雷帕霉素或他汀逆转或阻止VSMC表型转化,如果动脉瘤不发生或减弱了蛋白酶导致的动脉瘤形成,才能证实VSMC表型转化是动脉瘤形成的一个原因。
3.3 VSMCs表型转化与静脉曲张的关系
最近的一项研究通过比较健康人和静脉曲张患者静脉中 OPN、integrinβ3、SMA、SM-22 等的表达,发现静脉曲张组中OPN、integrinβ表达增加,SMA、SM-22表达减少,特别是在新生血管部位,表明静脉曲张组中未分化的血管平滑肌细胞增多。虽然通过免疫染色的方法发现在静脉曲张患者中血管中膜还可以见到SMA阳性细胞,但是在新生血管处SMA阳性细胞大大减少。电镜下观察VSMCs超微结构发现,静脉曲张组VSMCs中核膜部分破裂,线粒体、高尔基体、内质网增多,符合未分化型VSMCs的特点。以上实验结果均表明VSMCs表型转化参与了静脉曲张的病理过程[5]。
4 小结
VSMCs的分化与去分化是一个受多种因素调控的复杂过程,在这一过程中可出现多种细胞表型,不同表型的VSMCs参与了多种血管疾病的病理生理过程。目前VSMCs表型转化领域面临的问题主要包括:(1)不同 VSMCs表型之间的明确标志物还有待发现;(2)VSMCs表型转化的细胞内分子机制有待进一步阐明。这也是当今VSMCs表型转化研究的热点和难点。