溶瘤腺病毒的安全性研究进展

鲁克庆 王志平

作者单位：730030 兰州 兰州大学第二医院泌尿外科研究所；甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室；甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心

综述

溶瘤腺病毒的安全性研究进展

鲁克庆 王志平

作者单位：730030 兰州 兰州大学第二医院泌尿外科研究所；甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室；甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心

溶瘤腺病毒又称条件复制性腺病毒（conditionally replicating adenovirus，CRAD），是一种用于肿瘤治疗的生物制剂，其安全性备受人们的关注，如何系统化评价其毒性是应用于临床的关键步骤。近年来，对于溶瘤腺病毒安全性的报道越来越多，包括从特异性杀伤肿瘤细胞的细胞实验到动物的毒理实验等。本文对溶瘤腺病毒的细胞实验、荷瘤小鼠治疗的毒性、动物急性毒性实验及长期毒性实验、生殖毒性实验的研究及其评估方法和目前临床研究状况进行综述。

溶瘤腺病毒；安全性；毒性；评估方法

目前，尽管溶瘤腺病毒的体内、体外实验已取得较好的抗肿瘤效应，但大多数溶瘤腺病毒尚未应用于临床。究其原因，主要是由于其安全性问题令人担忧。溶瘤腺病毒作为一种基因工程改造的病毒，免疫原性较强，在宿主体内具有引起超敏反应的可能。除此之外，还有一些流感样毒性症状包括寒战、发热、乏力、肌肉疼痛等，以及许多未知的毒副反应和安全隐患。为此，进行溶瘤腺病毒的安全性评价非常必要。目前对于溶瘤腺病毒的安全性研究主要是以细胞实验和动物实验为主，临床试验进展较为缓慢。

1 溶瘤腺病毒的体外实验

体外的安全性研究是进行安全性评估的第一步，其研究包括将溶瘤腺病毒分别转染肿瘤细胞和正常组织的细胞，实验结果主要依靠给药后细胞计数，电镜下观察细胞内的病毒颗粒，检测溶瘤腺病毒对正常细胞和肿瘤细胞ca s pa s e3活性的影响，分析在细胞凋亡中的作用和差异，检测溶瘤腺病毒相关基因在正常细胞和肿瘤细胞中的表达差异，一般使用W e st e r n blot法对表达的病毒蛋白进行检测，R T-P C R技术检测病毒稳定性和转染效率。通过这些方法基本上可以确定病毒在正常细胞和肿瘤细胞中的表达差异。在A d-PS CAE-U P II-E1A-A R的研究［1］中发现，在其有效剂量的应用时，对正常细胞的损伤很小，正常细胞的E1A蛋白含量与肿瘤细胞相比明显下降。含荧光蛋白的A d-PS CAE-U P II-L U C在荧光显微镜下，荧光蛋白L U C在正常的膀胱细胞系S V-H U C-1中的表达明显低于膀胱肿瘤细胞。另外ON Y X-015能够在p53基因突变的肿瘤细胞中复制，V C N-01能够在p R B信号通路缺陷的细胞中复制［2］，这两个基因在肿瘤细胞中常常突变，而在正常细胞中通常起到选择性作用。这些都说明溶瘤腺病毒在体外实验研究中是比较安全的。

2 溶瘤腺病毒的体内实验

溶瘤腺病毒在体内实验的安全性评价是其进入临床实验并应用于临床的关键。国家食品安全性毒理学评价程序规定：食品药品安全性毒理学评价实验主要包括四个阶段：第一阶段为急性毒性实验；第二阶段为遗传毒性实验、传统致畸实验、短期喂养实验；第三阶段为亚慢性毒性实验——90 d喂养实验、繁殖实验；第四阶段为慢性毒性实验。目前溶瘤腺病毒体内的安全性评估主要包括荷瘤小鼠的治疗和毒性实验、正常小鼠的急性和长期毒性实验、生殖毒性和发育毒性实验。其结果的评估主要集中于溶瘤腺病毒对动物一般行为的观察、体重变化、血液学的变化和各个组织器官病理学的改变等。

2.1 荷瘤小鼠的毒性评价

对裸鼠进行皮下注射肿瘤细胞，制作裸鼠荷瘤模型，这是最常用的肿瘤造模方法。小鼠肿瘤模型的建立主要用于药物对肿瘤组织的杀伤和抑制作用的检测，其安全性评价是次要作用，只能作为药物系统的安全性评价的前期研究。溶瘤腺病毒治疗荷瘤小鼠安全性的研究很多，主要集中于溶瘤腺病毒对组织器官损伤的病理学研究和炎症反应。以腺病毒M7和腺病毒M8在治疗小鼠胃癌模型中发现，两种腺病毒均有明显杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤转移的作用，并且其毒性和安全性与对照组的A dv-T K（一种安全的腺病毒）相类似［3］。马步云等［4］在Z D55-X A F1治疗荷瘤小鼠的研究中，发现小鼠心脏、脾脏和肾脏均有水肿，肝脏有明显的核固缩和坏死，提示该剂有一定的毒性。在A d-E G F P-M DR1治疗大肠癌的小鼠皮下肿瘤的研究中，结果显示动物体内抗体在给药几天后增加，外周血液中白细胞无明显变化，M DR1蛋白的表达在肺、睾丸、肾脏中呈阳性，但在肝、脾、脑中为阴性［5］。说明溶瘤腺病毒在治疗肿瘤的同时，其安全性较好，有轻微毒性但可耐受。另外毒性可出现在睾丸组织中，因此进行生殖毒性实验也是十分必要的。

2.2 小鼠的急性毒性实验和长期毒性实验

急性毒性实验又称单次给药毒性实验，是指动物1天内多次或单次给药后，在14 d中连续观察动物所产生的毒性反应及死亡情况。其目的是了解药物单次或短时间内多次给药后，实验动物所产生的毒性反应及严重程度，计算新药相对毒性参数，为临床安全用药及监测提供一定的参考。创新药必须至少使用两种实验动物，常用的啮齿类动物为小鼠和大鼠，非啮齿类动物主要常用猴或小型猪。给药方法以最大剂量给药法最为常用。观察时间一般为14 d。

重复给药毒性实验，或称长期毒性实验，即反复多次对动物给药，观察药物对动物的毒性反应，一般是指连续给药14 d以上。其目的为观察连续反复给药时，实验动物出现的毒性反应、剂量与毒性效应的关系、主要毒性靶器官、毒性反应的性质和程度以及是否可逆等；还可观察连续反复给药时，实验动物的耐受剂量、无毒反应剂量、毒性反应剂量及安全范围；有无迟发毒性实验、有无蓄积毒性或受试动物对药物的耐受性等。长期毒性实验是非临床安全性评价的主要内容，是能否过渡到临床试验的主要依据，也为临床安全用药剂量设计提供参考依据，并为临床毒性和毒副反应的监护及生理、生化指标检测提供依据。剂量分组一般分为低剂量组、中剂量组、高剂量组三个实验组，以便观察和分析不同剂量的毒性反应，为临床制订用药剂量提供依据。

在药物毒性评价中，急性毒性评价和长期毒性实验是密不可分的，除长期毒性实验给药的剂量和动物的分组更为复杂、观察时间较长外，其给药方式、观测时间、检查指标都相似，因此通常将这两组实验放在一起以便于研究。在新型溶瘤腺病毒S G600-P53的研究［6］中，对小鼠和豚鼠进行急性毒性实验，结果显示给药17min后实验动物出现精神萎靡、闭眼、对声音的敏感性增加。这些症状在30min后恢复，给药40min后进食，无惊厥、抽搐和其他异常改变，观察期间注射部位无炎症、硬结、溃疡。动物给药两周内体重有所差异，两周后无明显改变。另外在大鼠和猕猴重复给药实验［6］中，给药期结束动物出现进食减少；血液中W BC、R e t、P L T、A S T增加；R BC、H G B、H T C、ALB和T CH O减少，这些改变实验结束时均恢复正常。S u等［6］的研究在S G600-P53处理组体内均检测出相应的抗体，在给药结束期和实验结束期，免疫组化法分析S G600-P53在动物注射部位的肌肉和脾脏组织中被检出，但是在脑、心、肺、肝、肾、睾丸、前列腺和子宫等均未发现。

溶瘤腺病毒r A d5-h T E R T27在大鼠和猴子的急性毒性实验［7］中，显示出较好的耐受性。实验动物的一般状况无明显改变，体重和食品的消耗没有明显差异，在系统解剖中也未发现异常改变。血液中W BC、R BC、H G B、P T、P L T和A P TT的改变都在正常范围内；血液生化指标A S T、AL T、CK、AL P、T P、ALB、G L U、T BIL和CH O L的改变均在正常范围内。近年在溶瘤腺病毒I N G N007［8］、突变型M1［9］、腺病毒A d-R EIC［10］的急性毒性实验中，除了I N G N007在给药10min后实验动物出现轻微的行为异常和肝功能出现可逆的轻度损伤外，在体重、进食量、行为、反应的敏感性等一般状况，以及血液生化和组织病理学等方面均无明显改变，其余各项指标均正常。另外在腺病毒A d V E G F-A ll6A+急性毒性实验和长期毒性实验［11］中，对照组和实验组的各项指标没有明显差异，病理组织检查也未发现腺病毒相关的改变。

急性毒性实验和长期毒性实验是药物安全性评价最为重要的两个实验，也是决定新药能否进入临床的关键性实验。毒性实验的观察应从定性和定量两方面进行，定性观察就是观察服药后实验动物有哪些中毒表现，其毒性反应出现和消失的速度如何，涉及哪些组织和器官，最主要的可能毒性靶器官是什么，损伤的性质及可逆程度如何，中毒死亡有哪些特征，可能的死亡原因等。定量观察就是观察药物毒性反应和剂量的关系。在上述溶瘤腺病毒的体内实验中，我们通过实验数据分析认为，溶瘤腺病毒在动物的急性和长期毒性实验中具有较好的安全性。

2.3 生殖发育毒性实验

以病毒为载体的基因生物制剂在进入人体后，有些可以通过随机同源重组或逆转录的形式整合到宿主的基因组中，有些可以表达导入的靶基因，这两种情况将影响宿主基因的表达，有可能激活一些原癌基因和失活一些抑癌基因，引起宿主肿瘤的发生。若发生在生殖细胞中则会遗传给后代，造成严重不良后果。国家药监局建议凡是能够影响基因表达的生物制剂均要进行相关的生殖发育毒性实验。目前研究认为以腺病毒为载体的生物制剂不能整合到宿主的基因组中［12，13］，但多数研究表明重组腺病毒可以表达相关的基因，分布于宿主的生殖器官中，可能有致突变作用和致子代畸形的毒性。因此，对于溶瘤腺病毒进行相应的生殖毒性检测是非常有必要的。

目前，生殖毒性实验通常首选三个阶段实验，即生育力及早期胚胎发育、胚胎-胎仔发育实验和围生期发育［14］。该研究的目的是反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩等亲代的生殖功能，以及对子代胚胎-胎儿的发育、出生后发育的不良影响。生育力及早期胚胎发育实验是指在雌雄动物交配前到交配期直至胚胎着床给药，评价受试物对动物生殖的毒性或干扰作用，评价内容包括配子成熟度、交配行为、生育力、胚胎着床前段和着床。对雌性动物，应观察药物对动情周期、受精输卵管转运、着床及胚胎着床前发育的影响。胚胎-胎仔发育实验指妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合阶段（大小鼠孕后第6～15天）给药。评价药物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响。该段实验的评价内容包括药物对妊娠动物的毒性、胚胎-胎仔死亡、生长改变和结构变化等致畸效应。围生期发育实验用于评价从着床到断奶时期给药对妊娠或哺乳的雌性动物及胚胎和子代发育的不良影响。

3 溶瘤腺病毒的临床试验

迄今溶瘤腺病毒大多处于实验研究阶段，真正应用于临床试验尚不多。目前正处于临床试验阶段的主要有溶瘤腺病毒C G0070，用于非肌肉浸润性的膀胱肿瘤患者治疗并进行了临床Ⅰ期试验研究［15］，当给药2～5 d后，58.3%的患者尿中含有C G0070，约经10.4个月后被清除。此外，溶瘤腺病毒KH901用于头颈部肿瘤治疗亦进行了临床Ⅰ期试验［16］，患者除有一些轻微的流感症状外，无其他毒副反应，血液中可检测到患者的病毒抗体。由人端粒酶逆转录酶基因启动子控制表达C D40配体（C D40L）的溶瘤腺病毒C G T G-40L［17］和R b信号通路且病毒趋向性改进的溶瘤腺病毒A d5-△24-A r g-G l y-A s p（R G D）用于复发的恶性卵巢癌治疗［18］，均进行了临床Ⅰ期试验研究，结果显示瘤内注射C G T G-40L的9例患者，没有观察到明显的毒副反应，使用R G D的患者除了发热、疲乏外，无明显的严重毒副反应发生。胡永超等［19］研究携带自杀基因（T K）的溶瘤腺病毒A d-E T K治疗实体肿瘤患者的安全性及临床疗效。结果表明患者除寒颤、发热、乏力、肌肉酸痛等流感样症状外，均表现出良好的可行性和耐受性。

目前，首个进入临床试验阶段的溶瘤腺病毒ON Y X-015［20］，主要用于头颈部肿瘤的治疗，已经完成临床Ⅲ期试验。在多中心性临床研究中，ON Y X-015显示出较好的安全性［21］。特别是和化疗药物联合应用时，具有明显的协同作用，肿瘤的缓解率大大地提高［22］。在肯定药效和体内安全性生物性分布及其安全性评价的数据基础之上，我国自主研发的溶瘤腺病毒试剂H101（安柯瑞），已经完成了临床Ⅰ期［23］、临床Ⅱ期［24］、临床Ⅲ期［25］试验，结果均显示具有良好的耐受性。2005年由我国食品药品监督管理局批准H101应用于临床，成为首个应用于临床的溶瘤腺病毒制剂。自此，溶瘤腺病毒从基础研究到临床应用迈出了历史性的一步。

4 展望

肿瘤的基因治疗是继传统手术、化疗、放疗之后的第四大肿瘤治疗手段。溶瘤腺病毒治疗肿瘤是一项比较新的肿瘤治疗手段，也是有望攻克肿瘤的一种治疗方法。目前，溶瘤腺病毒的研究大多处于实验阶段，尚未能广泛应用于临床，究其原因就是其安全性问题。相信随着人们对溶瘤腺病毒在体内代谢的认识、系统的安全性评价、体内清除机制等研究的深入开展，溶瘤腺病毒将会取得令人信服的安全性评价。期待溶瘤腺病毒能够成为肿瘤治疗的重要方法以造福于广大肿瘤患者。

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［2014-12-09收稿］［2015-01-05修回］［编辑 阮萃才］

R373

A

1674-5671（2015）01-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.01.13

王志平。E-mail：erywzp@lzu.cn