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埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白与呼吸系统疾病的相关研究进展

2015-01-22赵妍,孙耕耘,尤青海

中华肺部疾病杂志(电子版) 2015年4期
关键词:细胞骨架肌动蛋白通透性

埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白与呼吸系统疾病的相关研究进展

赵妍孙耕耘尤青海

作者单位: 230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院呼吸内科

【关键词】埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白;上皮细胞;内皮细胞;急性呼吸窘迫综合征;支气管肺癌;肺纤维化

埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin, ERM)是真核细胞内广泛表达的一种细胞骨架结合蛋白,可连接膜蛋白和肌动蛋白,参与细胞极性、形态维持、粘附、浸润、迁移及信号转导等过程[1-4]。ERM蛋白对调节细胞生命活动如细胞生长、凋亡、运动等起重要作用,并在呼吸系统疾病中与急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)、肺纤维化、肺癌等有着密切联系。因此,研究ERM蛋白的功能及相关信号转导通路有着深远意义。现从细胞和组织水平分别介绍ERM蛋白与呼吸系统相关疾病的研究进展。

一、ERM蛋白

ERM蛋白家族是由结构上紧密相关的埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白组成,每种蛋白均由高度同源的N端、中间的alpha-螺旋和带有高电荷的C端构成。ERM三种蛋白的N末端在一级结构上80%同源,称为FERM(four-point-one-ERM)。Moleirinho等[3]研究发现目前已知的含FERM结构的蛋白共分为三类:①Talins(踝蛋白)和Kindlins;②ERM蛋白、GEFs(鸟嘌呤核苷酸交换因子)、激酶和磷酸酶;③肌球蛋白和KRITS(Krev相关阻遏蛋白)。对Moesin等蛋白的 FERM区域分子结构进行分析,发现FERM为大约300个氨基酸构成的富半胱氨酸的疏水区域,有F1、F2和F3三个结构域,三个结构域相互作用,在空间构象上形成一个类似球形的三叶草形状,ERM蛋白可通过FERM区域与跨膜蛋白、脚手架蛋白和信号转导分子等不同类型的蛋白相互作用[1-3]。ERM蛋白C末端约34个氨基酸序列可与肌动蛋白相结合,因此,它通过连接膜蛋白和肌动蛋白而起桥梁作用,参与细胞形态维持、粘附、浸润、迁移等细胞生命活动。

虽然ERM三种蛋白在细胞内共存、活化方式及胞内定位高度相似,但它们仍表现出不同的细胞和组织特异性[2]。Ezrin主要分布在胃肠道、肺脏和肾脏,Moesin分布在肺脏和脾脏,Radixin主要分布在肝脏。在不同细胞中三种蛋白表达量也存在差异:Ezrin主要表达于上皮细胞和间质细胞,Moesin在内皮细胞和淋巴细胞,Radixin主要在肝细胞表达。

ERM蛋白主要分布在富肌动蛋白的细胞膜表面结构,如微绒毛、丝状伪足、膜皱褶等,其特殊的分布与其功能的发挥相一致。应用反义寡核苷酸抑制ERM蛋白表达可明显破坏上皮细胞微绒毛结构,削弱细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质粘附,细胞极性消失,而过度表达ERM蛋白可显著增强细胞粘附和细胞形态维持[2-4];表明ERM蛋白可能通过与肌动蛋白和膜蛋白结合参与皮质肌动蛋白重组。进一步研究发现,ERM蛋白在内皮屏障和上皮屏障功能机制的调控中起重要作用,这与它参与细胞骨架重排密不可分;此外,最近报道ERM蛋白在肿瘤的发展、侵袭和转移过程中也扮演着重要角色[4-9]。

二、ERM相关信号转导通路

ERM蛋白与膜蛋白或肌动蛋白结合不仅仅限于结构上,而且表现在功能上,即ERM蛋白通过与信号转导分子相互作用激活相应效应分子如蛋白的磷酸化从而发挥不同的生物学功能。在非活化状态下,ERM蛋白通过N端和C端首尾相连覆盖膜蛋白和肌动蛋白结合位点。ERM蛋白的活化大多是通过C端苏氨酸(Ezrin Thr567、Moesin Thr558、Radixin Thr564)磷酸化[9-10],也可发生酪氨酸(如Ezrin T567或Y447)磷酸化[11-12],因此,它们作为丝/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的底物而被磷酸化,如PKC-α磷酸化Ezrin Thr567位点,PKC-θ磷酸化Moesin Thr558位点,Rho激酶磷酸化ERM蛋白。此外,当细胞内PIP2(磷脂酰肌醇二磷酸)浓度较高时,ERM蛋白与PIP2直接结合是磷酸化苏氨酸相关位点的另一种方式。ERM蛋白无论以何种形式磷酸化,最终均发生构象改变,分子内首尾断开,暴露出膜蛋白和肌动蛋白结合位点,从而连接膜蛋白和肌动蛋白而起桥梁作用。

当外来刺激激活Rho GTP,PIP2产生增加时,PIP2结合到ERM蛋白的N端而活化,活化后的ERM蛋白N端与Rho GDI(Rho GDP的解离抑制因子)结合,解离出Rho GDP,后者转变成Rho GTP,从而形成级联放大反应。因此,ERM蛋白可作为Rho GTP的上游和下游活化因子,通过募集Rho家族的正负调节因子在Rho GTP的活化中起关键作用,这一调节机制在恶性肿瘤浸润和转移过程中表现尤为突出。Rho GTP过度表达可使肿瘤细胞获得持续增殖、逃逸凋亡、发生侵袭和远处转移能力,人类许多系统的肿瘤组织均检测到Rho GTP(尤其是Rho A和Rac1)的过度表达,对发生转移的骨肉瘤组织标本检测发现Ezrin呈高表达,伴随Rac1和Rho A表达上调,而沉默Ezrin表达可抑制Rho GTP表达,提示肿瘤细胞的浸润和转移可能是通过Ezrin/Rho GTP途径实现的[5];下调Radixin在前列腺癌细胞可通过调节Rac1的活性而增加细胞-细胞粘附和抑制细胞迁移[4]。以上表明ERM蛋白参与细胞极性和迁移的调控。

最近研究发现:Ezrin可与PKA的调节亚基结合参与cAMP/PKA这一经典途径[13]。此外,ERM蛋白在Fas/FasL介导的细胞凋亡过程中起负调控作用[14],表明ERM蛋白通过与不同信号分子相互作用调控着细胞生长、增殖、凋亡等细胞的多种生命活动。

三、ERM蛋白在呼吸道相关细胞中的作用

1. ERM蛋白与肺血管内皮细胞: 在呼吸道炎症反应过程中,血管内皮细胞是炎症介质如肿瘤坏死因子-α(tumonr necrosis factor-α, TNF-α)、脂多糖、凝血酶等主要损伤的靶细胞。肺血管内皮屏障功能受损引起内皮细胞通透性增高、肺通气/血流灌注比例失调,最终导致肺水肿和呼吸衰竭。大量研究表明细胞骨架重排和解聚与内皮细胞收缩性密切相关,在维持血管通透性方面起重要作用。ERM蛋白作为细胞骨架结合蛋白,将膜蛋白和肌动蛋白紧密连接,对细胞骨架重排起调控作用,因此,研究ERM蛋白在肺血管内皮细胞中的功能十分必要。

应用TNF-α刺激人肺微血管内皮细胞通透性增高过程中,观察到磷酸化ERM蛋白(p-ERM)表达上调且向胞膜侧聚集,伴随细胞骨架聚集,P38-MAPK、PKC、PI4P5K参与此过程调节,下调ERM三种蛋白表达可明显降低内皮细胞通透性[15]。 Rac GTP活化被认为是增强内皮屏障功能的正调节因子,对肺内皮屏障功能保护机制的研究发现,p-ERM和Rac1表达上调,沉默ERM蛋白可明显抑制Rac1活化,显著削弱内皮屏障功能[16];进一步对炎症介质诱导肺血管内皮细胞肌动蛋白骨架变化的调控研究发现,p-ERM表达上调且此过程受PKC调控,分别沉默Moesin和ERM均可明显抑制细胞骨架聚集,使内皮细胞通透性显著降低,沉默Radixin效应则相反[17]。以上表明ERM三种蛋白在内皮屏障功能机制的调控中存在差异,ERM蛋白对于维持肺血管内皮屏障功能起重要作用。

2. ERM蛋白和肺泡上皮细胞: 上皮向间质转化是肺泡上皮细胞损伤后修复的适应性反应,ERM蛋白作为细胞骨架结合蛋白,参与肺泡上皮细胞损伤和修复过程的调控。ERM蛋白主要集中在上皮细胞富肌动蛋白的顶端膜区域,其特殊分布与其功能的发挥相一致。在炎症因子刺激人A549细胞发生上皮向间质转化过程中,观察到p-ERM表达增多且主要分布在细胞周边,与重排后的细胞骨架分布一致,提示ERM蛋白可能通过调节细胞骨架重排参与上皮向间质转化的过程。当细胞与细胞外基质接触时,细胞发生延伸和迁移,而细胞粘附是细胞延伸和迁移的先决条件,Rap是参与调控细胞与细胞外基质粘附和延伸的一种小分子G蛋白。Ezrin在人A549细胞主要参与Rap-1诱导的细胞延伸,沉默Ezrin可明显抑制Rap-1导致的细胞延伸,Radixin和Moesin却无类似作用,表明Ezrin可能通过调控Rap-1导致细胞延伸起到参与细胞浸润和迁移的作用,这也为寻找抗肿瘤靶点提供了重要线索。

四、ERM蛋白与呼吸系统疾病

1. ERM与ARDS: 肺微血管通透性增高是ARDS发生的关键环节,各种因素导致肺血管内皮细胞屏障功能受损,都将引起肺微血管通透性增高,使富含大量蛋白质的液体渗入肺泡腔,最终导致肺水肿和难治性低氧血症,因此,ARDS血管外肺水含量增加与肺血管内皮细胞屏障破坏密切相关。进一步对ARDS发病机制的研究发现,细胞骨架重排在细胞收缩过程中起关键作用,而ERM蛋白作为细胞骨架结合蛋白,通过调控细胞骨架的重排影响着肺血管内皮屏障功能的发挥。

应用凝血酶体外复制人肺动脉内皮细胞通透性增高模型,观察到p-ERM明显增加,伴随细胞骨架重排,内皮细胞通透性增高,而肝素干预后可明显抑制p-ERM表达,使内皮细胞单层通透性显著降低。炎症反应是ARDS本质,如上所述[15-17],多种炎症介质诱导的肺血管内皮通透性增高过程中,均观察到p-ERM表达上调和细胞骨架聚集,而沉默ERM蛋白后细胞骨架未发生聚集,内皮细胞通透性也显著降低,提示ERM蛋白在调控肺血管内皮细胞通透性方面至关重要,对进一步探讨ARDS的发生机制有深远影响。

2. ERM与肺癌: 近年来发现Ezrin与肿瘤的浸润和转移密切相关,Ezrin在胞内表达和分布的异常是肺癌转移的特征。对Ezrin表达异常在肺癌浸润和转移中的作用,目前有两种观点:一种是Ezrin低表达促使肺癌浸润和转移;生理状态下,Ezrin起到维持细胞极性、细胞运动、细胞-细胞粘附和细胞-细胞外基质粘附等作用。Ezrin表达下调可破坏微绒毛结构、削弱细胞粘附,使细胞移动和迁移能力相应增强。比较肺癌和正常人肺组织Ezrin的表达变化,观察到癌细胞内Ezrin表达下降与区域淋巴结转移和远处转移有关,而与肺癌的大小、病理类型、组织分化程度无关;另一种观点认为Ezrin高表达是肺癌转移的促进因素,研究发现检测Ezrin在肺癌原发灶和淋巴结转移灶表达均明显增加,沉默Ezrin可通过增加E-钙粘蛋白等粘附分子的表达显著降低癌细胞转移能力。对4种具有不同转移潜能的人肺癌细胞系研究发现,Ezrin mRNA和蛋白表达水平与肺癌的转移能力呈正相关,并观察到转移潜能高的癌细胞伴有肌动蛋白多聚体和微丝结构的解聚,而微丝骨架的改变与Ezrin表达增加密切相关。此外,在其他器官如胃肠道、乳腺、子宫等恶性肿瘤中均检测到Ezrin高表达[6-8]。虽然上述两种观点对Ezrin在肺癌组织的表达变化截然相反,但其表达异常均与肺癌转移密切相关,且均观察到Ezrin在癌细胞内的重新分布,即Ezrin在非癌细胞内主要位于胞膜顶端,而在肿瘤细胞大多弥散在胞浆中[5]。以上表明Ezrin表达及亚细胞分布的改变对肺癌转移起重要作用,可能成为判断肺癌侵袭和转移的生物学标记物之一,是抗肿瘤药物作用的潜在靶分子。

Radixin和Moesin在肺部恶性肿瘤发生发展中也起调控作用。在肺腺癌组织检测到二者均呈低表达,可能对肺腺癌的发生起负调节作用。有报道,Moesin在非小细胞肺癌中的表达水平显著高于正常肺组织,且转移灶的表达高于原发灶。对非小细胞肺癌患者术后随访发现Moesin表达阳性者死亡率远高于表达阴性者,提示Moesin与非小细胞肺癌的发生发展密切相关,可能成为判断非小细胞肺癌预后的一个指标。

3. ERM与肺纤维化: 应用博来霉素复制小鼠肺纤维化模型,观察到Moesin缺失型鼠肺组织炎症反应和纤维化程度较正常鼠严重,小鼠体重和存活率明显下降,提示Moesin可能通过抑制炎症反应对肺泡结构起保护作用。在系统性硬化症患者的纤维化肺组织中观察到Ezrin、Moesin表达均上调,并伴随细胞外基质和胶原沉积增加。在特发性肺纤维化患者肺组织中也发现p-ERM表达明显增多,以上提示ERM蛋白可能参与了肺纤维化的发生发展。

紧密连接、粘附连接和缝隙连接是构成上皮屏障的结构基础,其中紧密连接在维持上皮屏障功能中起关键作用,上皮屏障功能紊乱对于囊性肺纤维化发生机制至关重要。囊性纤维化是一种家族常染色体隐性遗传病,由人7号染色体CFTR(cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator)基因突变引起,是一种累及多器官的疾病。在肺部病理生理表现为支气管上皮细胞离子分泌障碍而形成许多粘液栓,导致支气管阻塞和细菌大量繁殖,引起肺、支气管反复感染,严重损害肺功能,是导致囊性纤维化患者死亡的主要原因。研究表明CFTR主要分布在支气管上皮细胞顶端膜侧,NHERF-1(Na+/H+exchanger regulatory factor 1)作为脚手架蛋白,一端与CFTR相连,另一端与Ezrin相连,过度表达NFERF-1或CFTR均可通过CFTR-NHERF1 -Ezrin-Actin多蛋白复合体途径来弥补CFTR缺失引起的细胞顶端膜离子分泌功能障碍,并恢复细胞间紧密连接,去除与NFERF-1结合的Ezrin区域或Ezrin突变(T567A),即使过度表达NFERF-1也不能形成细胞间紧密连接,相反出现细胞通透性和多形核白细胞迁移力显著增高,提示Ezrin与肺上皮细胞紧密连接的形成密切相关,它对于维持上皮屏障功能的完整起调控作用。这为进一步研讨囊性肺纤维化的发生机制并从中寻找新的治疗靶点提供了重要依据。

ERM蛋白作为细胞骨架结合蛋白,参与细胞膜皮层肌动蛋白的重组及多种信号通路的转导,在呼吸道内皮和上皮屏障功能的完整中发挥重要调控作用,影响着ARDS、肺癌、肺纤维化等呼吸系统疾病的发生发展,但其具体机制及与其他信号途径之间相互影响、相互联系尚不完全清楚。进一步研究ERM蛋白复杂的调控网络机制和功能,将为寻求疾病治疗策略提供理论基础。

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(本文编辑:黄红稷)

赵妍,孙耕耘,尤青海. 埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白与呼吸系统疾病的相关研究进展[J/CD]. 中华肺部疾病杂志: 电子版, 2015, 8(4): 475-477.

·综述·

收稿日期:(2014-09-28)

文献标识码:中图法分类号: R563 A

通讯作者:孙耕耘,Email: sungengyun@tom.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81370170, 81100053)

DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.04.019

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