钙离子及蛋白激酶C在低氧肺动脉高压平滑肌细胞中的作用

钙离子及蛋白激酶C在低氧肺动脉高压平滑肌细胞中的作用

何俊毅施熠炜胡晓芸

作者单位： 030001 山西，山西医科大学第一医院呼吸科

【关键词】钙离子浓度，细胞内；蛋白激酶C；低氧；肺动脉平滑肌细胞

低氧性肺动脉高压的发病机制较为复杂，至今尚不完全清楚。目前已有研究表明，低氧性肺动脉高压是多种离子通道、信号分子以及相关细胞因子等相互作用的结果。低氧肺动脉高压的病理生理基础包括肺动脉内皮细胞功能失调、肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增生、肺血管收缩和原位血栓形成，其中低氧性PASMCs收缩和增殖在肺血管重构和肺动脉高压的形成和发展过程中发挥重要作用[1]。PASMCs增殖和凋亡比率的失衡是肺血管重塑的主要原因，而PASMCs的过度收缩同样也会导致肺血管的重塑[2]。PASMCs收缩和增殖信号转导过程中有着共同的信号转导途径，协同介导肺动脉高压的形成。目前越来越多的研究发现细胞内钙离子(intracellular calcium concentration，[Ca2+]i)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)不仅独立参与介导了低氧PASMCs的收缩和增殖，而且它们之间彼此相互作用。本文对近年来[Ca2+]i和PKC的一般生物学特征及两者在PASMCs收缩和增殖中作用的相关研究进展进行综述。

一、PASMCs内Ca2+的特征及其调控作用

1. [Ca2+]i的的生物学特征: Ca2+是体内重要的信号分子，PASMCs质膜钙通道和胞内钙池协同调控细胞内Ca2+的浓度水平。低氧可引起PASMCs内的[Ca2+]i增加，其主要途径包括细胞外钙跨膜进入和细胞内钙释放。很多研究认为低氧能使PASMCs膜电压门控性钾通道(voltage-gated potassium channel，Kv)表达减少且活性降低，细胞膜去极化，引起电压依赖性钙通道(voltage-gated Ca2+channels，VOCC)如L型钙通道开放，细胞外Ca2+内流，[Ca2+]i增加[3]。慢性低氧也可使PASMCs内钙池操纵性钙离子通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)开放，引起Ca2+库操纵性Ca2+内流，从而导致[Ca2+]i增加。瞬时受体电位通道蛋白(transient receptor potential channel，TRPC)作为SOCC的分子基础，在低氧时表达增加，参与了PASMCs中 [Ca2+]i的调节[4]。细胞外钙的进入能够触发细胞内钙的释放。另外低氧等刺激能够通过G蛋白激活磷脂酶C(PLC)-IP3通路，使得肌浆网(SR)的Ryanodine受体钙通道和内质网(ER)的IP3受体通道开放，细胞内钙释放，[Ca2+]i增加。传统的VOCC阻滞剂硝苯地平不能抑制低氧诱导的SOCC开放引起的Ca2+内流，主要原因是参与肺动脉高压的Ca2+信号通道是多途径的。

Ca2+作为细胞内重要的第二信使，是触发低氧PASMCs收缩、增殖等相关信号转导通路的始动因素，在低氧性肺动脉高压的发生发展过程中具有重要作用。[Ca2+]i不仅能诱发PASMCs的兴奋-收缩偶联机制调节肺血管收缩，也可以激活PASMCs的兴奋-转录机制，通过增加细胞因子的表达来促进肺血管重塑[5]。

2. [Ca2+]i调节PASMCs的收缩: 低氧介导的Ca2+内流增加可以上调[Ca2+]i，引起肺动脉血管环收缩效应增强，促进低氧肺动脉高压的形成。有研究表明，低氧可引起PASMCs膜去极化产生动作电位，细胞膜对Ca2+的通透性增加，[Ca2+]i增加，PASMCs收缩，而细胞膜去极化和血管收缩效应均可被Ca2+拮抗剂抑制，这提示低氧可直接作用于PASMCs膜上的钙通道，从而引起肺血管的收缩[6]。[Ca2+]i的升高促使Ca2+/CaM(calmodulin，钙调蛋白)复合物形成，随后激活肌球蛋白轻链磷酸酯酶 (myosin light chain phosphatase，MLCP)，导致肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)磷酸化，最终启动肌动蛋白-肌球蛋白收缩装置引起PASMCs收缩[7]。

3. [Ca2+]i调节PASMCs的增殖: [Ca2+]i升高可以触发细胞内增殖相关信号转导通路诱导PASMCs增殖[8]。低氧同样可以激活多种因子和信号通路参与介导PASMCs增殖的发生发展，如MEK/ERKl，2，骨形态形成蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP4)，内皮素-1 (endothelin-1, ET-1)和血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等。缺氧能够通过MEK/ERKl，2信号通路活化钙敏感受体，介导PASMCs 内[Ca2+]i升高，在肺动脉增殖过程中发挥重要作用[9]。Lu等[10]研究BMP4对大鼠远端PASMCs增殖的作用机制中发现：BMP4可能通过上调PASMCs中TRPC1，TRPC4，TRPC6的mRNA和蛋白水平的表达，导致SOCC及基础[Ca2+]i增加，最终促进肺血管重塑、肺动脉高压形成。李积凤等[11]认为低氧可使人PASMCs内的Ca2+呈时间依赖性的增高，并引起NFATc3转位至细胞核内，促使PASMCs增殖相关基因表达，导致PASMCs增殖。

Ca2+可通过多种途径调节转录因子的表达，在PASMCs的增殖和生长中发挥重要作用。升高的[Ca2+]i不仅可以使细胞核内Ca2+浓度的增加，促进处于休眠状态的PASMCs的增殖分裂[12]；也能激活Ca2+敏感蛋白的活性，参与上调c-fos和c-jun原癌基因的表达，促使ET-1和PDGF的合成增加，蛋白质、脂类合成功能增强，最终导致PASMCs的增殖和低氧性肺血管重塑[13]。

二、PASMCs内PKC的特征及其调控作用

1. PKC的生物学特征: PKC是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，参与调控PASMCs的收缩、增殖等信号转导通路。现已知PKC至少有10种亚型，根据它们的分子结构和对激活剂的敏感性分为三个亚组：经典型PKC(cPKCα, βⅠ, βⅡ和γ)，需要钙离子和二酰甘油(Diacylglycerol，DAG)激活；新奇型PKC(nPKCδ, ε, η和θ)；非典型性PKC(aPKCλ/ι和ζ )，它们广泛分布于细胞的胞质中且保持无活性状态，经低氧等外界刺激后转移至细胞膜转变为活化状态发挥作用[14]。在整体动物的实验研究中，我们应用免疫印迹和免疫组化的技术发现，在大鼠肺动脉平滑肌细胞中有cPKC(α, βⅠ, βⅡ)，nPKC(δ, ε, ↑)的表达[15]。PKC的多种亚型可通过调节Ca2+通道活性，改变PASMCs膜电位水平，介导低氧诱导的PASMCs收缩、增殖、分化和凋亡，参与低氧肺动脉高压肺血管收缩和重构。

2. PKC调节PASMCs的收缩: Tsai等[16]将低氧暴露时肺血管的收缩分为两个时相，第一时相发生在低氧暴露的1～3 min，为肺血管阻力快速上升期；第二时相发生在低氧暴露的10～15 min，肺血管阻力缓慢进行性增高。第一时相肺动脉短暂性收缩主要依赖PASMCs内[Ca2+]i的升高，而第二时相肺动脉持续性收缩可能为PKC信号通路的激活所致。其中第二时相可被PKC抑制剂(chelerythrine)阻断，这表明PKC参与了低氧诱导的肺血管收缩。有研究表明，低氧时PASMCs中PKCα、PKCε可以激活RhoA/ROCK，从而抑制MLCP，进而促进PASMCs的收缩[17]。也有学者认为PKC可以通过磷酸化CPI-17来抑制MLCP，使MLCP和肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)失衡，最终使MLC磷酸化导致PASMCs收缩[18]。

3. PKC调节PASMCs的增殖: Dempsey EC等发现低氧可以激活PKCα促进PASMCs增生[19]。近几年也有研究发现，PKC表达上调和功能活化本身不会导致细胞增殖，但PKC的活化通过其下游的一系列信号传导途径促使PASMCs的异常增殖，这可能是低氧参与肺血管重构的重要机制之一[20]。在体外培养的人PASMCs试验中有研究表明，低氧可使PKCβ-NF-κB信号转导通道激活，活化的核转录因子(nuclear factor-κB ，NF-κB)从细胞浆转移到细胞核内，认为PKC信号转导通道可能通过活化NF-κB参与缺氧性肺血管重建的过程，PKC活性抑制能使人PASMCs增殖相关基因表达减少，PASMCs增殖作用减弱[21]。

三、PASMCs内PKC与Ca2+的相互作用

低氧等刺激细胞外活性物质和G蛋白偶联受体都可激活磷脂酶C(phosphoinositol-spscific phospholipase C, PLC)水解PIP2导致脂质第二信使三磷酸肌醇(inositol-1,4,5, triphosphate, IP3)和二酰甘油(diacylglycerol, DAG)的产生。IP3可以与内质网(ER)的IP3受体结合，而DAG可直接激活内源性PKC。目前越来越多的研究证实Ca2+和PKC信号通路之间存在相互作用。[Ca2+]i是经典型PKC的辅因子，增加的[Ca2+]i可直接激活PKC，且PKC介导的磷酸化调节Ca2+通道活性。[Ca2+]i和PKC的相互作用启动了PASMCs收缩、增殖的级联反应。一些学者对活性氧化物(reactive oxygen species, ROS)在低氧肺动脉高压的研究中发现：低氧暴露可以促进PASMCs中线粒体ROS的产生，随后ROS作为一种重要的信号因子参与[Ca2+]i的升高和PKC的激活，从而诱导低氧肺动脉高压的形成[22]。

1. PKC对[Ca2+]i的影响

(1)PKC能够上调PASMCs 内[Ca2+]i： 有研究认为PKC信号通路可以通过增加[Ca2+]i而促进低氧PASMCs的增殖[20]。低氧能激活PASMCs的PKC信号通路，上调缺氧诱导因子-1、NF-κB的合成，最终导致Kv通道表达减少和活性下降[23]，使PASMCs膜去极化，Ca2+内流，导致[Ca2+]i升高从而促使PASMCs的增殖[24]。PKC信号通路除了能够降低Kv通道的表达，也可以激活TRPC，间接升高PASMCs 内[Ca2+]i。ET-1可以通过第二信使DAG激活PASMCs内PKC信号转导通路，促使促使TRPC通道开放，[Ca2+]i增高，TRPC通道激活作用可被PKC抑制剂或TRPC1抗体所拮抗，表明ET-1依赖PKC信号转导通路促使PASMCs内[Ca2+]i升高[25]。

最近有研究表明，慢性低氧PASMCs中ET-1与其受体结合后，可以通过激活PKC，活化Rho/Rho激酶信号，使VDCC通道开放，[Ca2+]i增高。PKC 激动剂PMA能够模拟ET-1 的作用促进VDCC通道开放，[Ca2+]i增高，PKC抑制剂则起相反作用[26]。同样ROS特别是H2O2也可通过PKC信号转导通路刺激钙通道的开放导致低氧性PASMCs的收缩。低氧可使PASMCs内ROS升高，随之激活PKCα、PKCε，激活的PKC可以抑制Kv通道，使细胞膜去激活化，L型钙通道开放钙离子内流，也可与肌质网质膜上钙通道蛋白兰尼碱受体(ryanodine receptors, RyR)结合，促使肌质网内钙离子释放，从而使PASMCs内[Ca2+]i增加，继而出现低氧诱导的PASMCs收缩[14]。另外Barman[27]在研究PKC在低氧性肺血管中的作用时发现，PKC拮抗剂和Ca2+阻滞剂均可以减弱肺血管的收缩作用，认为低氧激活的PKC信号通路可能引起L-型钙通道开放，细胞外Ca2+内流，导致低氧肺血管的收缩。

(2) PKC使PASMCs 对[Ca2+]i的敏感化增加：近年来也有研究发现，低氧时PLC-PKC信号转导通路的激活可增强PASMCs收缩成分对Ca2+的敏感性，使得PASMCs在基础或低水平[Ca2+]i情况下就可收缩，这是导致低氧性肺血管收缩重要原因[28]。同样Snow等[29]在大鼠整体模型中发现，间断低氧虽然不能使PKC βⅠ, PKCβⅡ的表达量增多，但可通过增加蛋白PKCβⅠ，PKCβⅡ的膜转位水平来促使其活性增加，同时激活的PKC使PASMCs对Ca2+的敏感性增加，通过其受体活化PASMCs内的一系列信号蛋白分子而诱导与收缩、增殖等相关的反应基因表达，从而参与低氧性肺动脉高压的发生发展。

2. [Ca2+]i对PKC的影响: 经典型PKC(cPKCα, βⅠ, βⅡ和γ)的激活需要Ca2+和DG参与[17]。低氧暴露可引起PASMCs内[Ca2+]i的显著升高，[Ca2+]i作为PKC激活的第二信能够改变Ca2+依赖型PKC的活性。

缺氧是肺动脉高压形成的关键因素，血管内皮细胞在其中起着重要的中介作用。一些报道认为，缺氧可刺激内皮细胞合成和分泌ET-1、PDGF、5-羟色胺和血栓素A2等因子促进PASMCs增殖，导致肺动脉高压的形成[30]。ET-1诱导细胞增殖的信号传导途径是通过膜表面的G蛋白偶联的受体和肌醇磷脂系统使细胞内[Ca2+]i浓度增高，而后激活PKC信号转导途径，随后通过Ras-Raf-MAPK途径促进靶细胞增殖，导致MAPKs核转位进入核内激活一系列生长相关基因的表达，引起细胞增殖和生长反应[31-33]。低氧等刺激作用于PASMCs时，经G蛋白的偶联作用激活膜内的PLC，可使第二信使IP3，DG产生。IP3进入胞浆促使细胞内Ca2+大量释放入胞浆，从而使[Ca2+]i增高；而DG与PKC结合，可降低PKC活化所需的Ca2+浓度，并与Ca2+协同促使PKC从胞浆转移至胞膜而被激活，促进蛋白多糖的合成，从而引起血管平滑肌细胞增殖。Eon等学者在低氧小鼠PASMCs中发现PKC可以激活Na+-H+交换，使细胞内pH增加，升高的pH同样可以使PASMCs的Kv通道活性下降，使胞浆内Ca2+浓度增加，从而产生低氧性PASMCs收缩和增殖[34-38]。

低氧性肺动脉高压是一组由不同发病机制引起的以肺血管阻力持续增加为特征的生化级联反应，其中[Ca2+]i和PKC信号通路及两者在低氧PASMCs收缩及增殖中的相互作用仍是近年来研究的热点。[Ca2+]i和PKC信号通路在低氧PASMCs的收缩和增殖参与了低氧性肺血管重构和肺动脉高压的形成和发展过程。鉴于Ca2+进出细胞的通道复杂，PKC多种亚型在生理及病理状态的作用不同，且在诸多细胞信号转导通路中它们存在复杂的相互作用，因此仅依赖一种药物干预或延缓肺动脉高压的形成效果仍较差。在细胞水平继续探究PASMCs收缩和增殖信号通路中的Ca2+通道及确切PKC亚型的共同转导通路，以便靶向干预特异的PKC亚型，为肺动脉高压的临床治疗提供新的方法。

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(本文编辑：王亚南)

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·综述·

收稿日期：(2015-03-20)

文献标识码：中图法分类号： R563 A

通讯作者：胡晓芸，Email: huxiaoyunly@sina.com

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.04.025