辛酸盐对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸摄取、转运和活化相关蛋白表达的影响

2015-01-21刘莉莉程玉鹏李慧玲蒋倩倩丁常宏国立东杨炳友

饲料工业 2015年13期

■刘莉莉程玉鹏李慧玲蒋倩倩高宁丁常宏国立东杨炳友

（黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040）

乳脂肪是牛乳的主要营养成分，牛乳中的脂类物质含量通常占4%[1]，其中甘油三酯是乳脂中最主要的脂类物质，其次是甘油二酯、少量的磷脂、胆固醇及小部分的游离脂肪酸（FA）[2]。奶牛乳脂肪合成涉及多个代谢途径，主要包括FA摄取、转运和活化，FA的内源合成，FA去饱和作用，FA酯化，脂滴形成和分泌等过程，其中需要多种参与乳脂肪合成的关键酶和蛋白发挥作用。

研究发现FA可作为细胞中的信号分子，通过特定膜受体介导，启动细胞内信号通路从而发挥生物学作用[3]。FA本身可以调节脂肪的稳衡状态，而且可以调节生脂相关基因的表达[4]。FA也是乳腺组织摄取的一种重要营养素，其对乳腺上皮细胞的生长、增殖具有一定的作用。有研究报道多种不同的短链FA和长链FA能改变哺乳动物乳腺上皮细胞内脂肪酸从头合成基因、甘油三酯合成基因、转录调控因子基因及其它生脂基因的表达，进而参与调控乳脂肪的合成[5-6]。

然而，目前中链脂肪酸对奶牛乳腺乳脂肪合成的影响还不十分清楚，本试验对DCMECs添加饱和八碳脂肪酸辛酸（C8∶0），拟研究其对乳腺上皮细胞脂肪酸摄取、转运和活化相关蛋白CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2 mRNA表达和蛋白表达的影响，本试验为深入探讨脂肪酸对乳脂肪合成的影响机理及为反刍动物乳脂肪合成的营养调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

奶牛乳腺上皮细胞，辛酸钠（Sigma），DMEM/F12培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，实时荧光定量PCR试剂盒SYBR®Primx Ex TaqTM（TaKaRa），Prime ScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa），去除脂肪酸的牛血清白蛋白（Sigma），CD36 Antibody(Santa)，FABP3 Antibody(Santa)，ACSL1 Antibody(Santa)，ACSS2 Antibody(Santa)。

1.2 DCMECs培养和处理

采用生长培养基(DMEM/F12+10%FBS)于37℃，质量分数为5%的CO2条件下培养DCMECs。收集对数生长期乳腺上皮细胞等密度接种于6孔板中，待细胞融合度达到80%～90%时，将细胞转入无脂无血清培养基（DMEM/F12+1 g/l BSA）培养24 h，更换新鲜无脂无血清培养基并添加不同浓度的辛酸钠，辛酸钠的终浓度分别为0、0.5、1、2 mmol/l，每组3个平行，培养48 h后，收集细胞用于相关指标的qRT-PCR和Western blotting检测。

1.3 引物设计

使用Primer5.0软件设计各基因qRT-PCR的上游、下游引物（见表1）。

表1 基因的qRT-PCR引物序列

1.4 DCMECs总RNA提取、cDNA合成及各基因的qRT-PCR检测

用Trizol试剂提取DCMECs总RNA。按照Prime ScriptTMRT reagent Kit说明书对RNA逆转录，使用SYBR®Primx Ex TaqTM试剂盒进行基因的qRT-PCR检测。每个基因进行3次平行实验。各基因的qRTPCR结果采用2-ΔΔCT相对定量的方法（β-actin基因为参照基因）计算目的基因的mRNA表达丰度[7]。

1.5 乳腺上皮细胞总蛋白提取

用2×SDS上样缓冲液提取细胞总蛋白质，收集并于-20℃冻存备用。

1.6 Western Blotting检测

配制浓缩胶和分离胶进行SDS-PAGE分析，电泳结束后将凝胶上的蛋白转印到硝酸纤维素膜上，对膜进行脱脂牛奶封闭，一抗、二抗孵育，发光液显色，暗室中曝光、显影。采用Band Scan 5.0软件对Western blotting图谱进行灰度扫描，X光胶片上蛋白条带经扫描和Bandscan软件读取密度值后，与由同一转移膜所测得的β-Actin蛋白比较得出蛋白的相对含量。

1.7 数据处理

应用SAS 9.1统计学软件进行单因素方差分析，实验数据以平均数±标准差（X±S）表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 辛酸钠对CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2基因表达的影响

采用 qRT-PCR 检测DCMECs的CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2各基因mRNA的相对表达量，结果如图1～图4所示。与未添加辛酸钠的乳腺上皮细胞相比，0.5～2 mmol/l的辛酸钠对细胞CD36和ACSL1基因的表达无显著性影响（P>0.05），但0.5～2 mmol/l的辛酸钠以浓度依赖的方式降低或显著降低细胞FABP3和ACSS2基因的表达（P<0.05）。

2.2 辛酸钠对CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2蛋白表达的影响

采用Western blot检测DCMECs的CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2各蛋白的相对表达量，结果如图5～图9所示。

图1 辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞CD36基因表达的影响

图2 辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞FABP3基因表达的影响

图3 辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞ACSL1基因表达的影响

图4 辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞ACSS2基因表达的影响

图5 辛酸钠处理奶牛乳腺上皮细胞CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2蛋白表达的Western blotting结果

图6 辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞CD36蛋白表达的影响

图7 辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞FABP3蛋白表达的影响

图8 辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞ACSL1蛋白表达的影响

与未添加辛酸钠的乳腺上皮细胞相比，0.5～2 mmol/l辛酸钠对细胞CD36和ACSL1蛋白的表达无显著性影响（P>0.05），但0.5～2 mmol/l辛酸钠以浓度依赖的方式降低或显著降低细胞FABP3和ACSS2的蛋白表达（P<0.05）。

3 讨论

图9 辛酸钠对奶牛乳腺上皮细胞ACSS2蛋白表达的影响

乳脂肪中的甘油三酯是以3个FA酯化到甘油-3-磷酸骨架的形式存在。乳脂肪合成需要的FA主要有两个来源：乳腺上皮细胞中从头合成FA及从饮食或者动员体脂获得FA[8]。反刍动物从血液摄取的用于乳脂肪合成的长链FA主要来自饮食和从消化道吸收的微生物FA，而乳脂肪中不到10%的FA来自于体脂动员。有证据表明长链脂肪酸的膜运输是一个促进过程[9]。分化抗原簇36（CD36）和脂肪酸结合蛋白3（FABP3）在FA的摄取和运输中发挥作用。CD36是一种乳脂球膜蛋白，是长链FA的转运蛋白[10]，CD36在摄取FA进入奶牛乳腺细胞时起到非常重要的作用[11]。FABP3是细胞内脂结合蛋白家族，主要参与细胞内脂肪酸的运输，可将脂肪酸从细胞膜上运送到甘油三酯和磷脂合成位点[12]。Acyl-CoA合成酶长链家族成员1（ACSL1）和Acyl-CoA合成酶短链家族成员2（ACSS2）分别能活化细胞内LCFA和SCFA，以激活进入乳腺上皮细胞的脂肪酸，用于甘油三酯合成[13]。

研究发现短链FA和长链FA能影响乳腺上皮细胞中脂肪酸摄取、转运和脂肪酸活化相关蛋白基因的表达。一定浓度的乙酸钠能下调DCMECs的CD36 mRNA水平，上调FABP3 mRNA水平[14]。饱和LCFA会增加DCMECs中FABP3的mRNA丰度，不饱和LCFA一般会降低FABP3的mRNA丰度，而且一定浓度的软脂酸能使DCMECs的CD36的转录水平显著升高[15]。100 μmol/l的十八碳脂肪酸能明显促进DCMECs的ACSL1的mRNA表达[16]。0.625～5 mol/l亚麻酸极显著上调CD36基因的表达，而较高浓度亚麻酸能下调ACSL1和FABP3基因的表达[17]。有研究报道，辛酸盐能影响小鼠脂肪细胞（3T3-L1）和人脂肪细胞甘油三酯的合成及相关生脂基因的表达[18-19]。本课题组前期研究结果也发现辛酸盐能抑制DCMECs甘油三酯合成，并对脂肪酸合成关键酶和硬脂酰辅酶A去饱和酶、甘油三酯合成关键酶等的表达具有抑制作用[20-22]。然而，辛酸盐对DCMECs脂肪酸摄取、转运和脂肪酸活化相关蛋白的表达还不清楚。

本研究检测了不同浓度辛酸钠处理的DCMECs中参与脂肪酸摄取、转运和脂肪酸活化相关蛋白CD36、FABP3、ACSL1和ACSS2的mRNA水平和蛋白水平表达的变化。结果表明，添加0.5～2 mmol/l的辛酸钠对细胞CD36和ACSL1的基因表达和蛋白表达无显著影响，但0.5～2 mmol/l的辛酸钠能以浓度依赖的方式降低或者显著降低细胞FABP3和ACSS2的基因表达和蛋白表达。说明辛酸盐能负向调控DCMECs中脂肪酸转运蛋白和短链脂酰辅酶A合成酶的表达，从而抑制脂肪酸的转运及短链脂肪酸的活化，进而影响DCMECs乳脂肪的合成。这与前人用辛酸盐对其他细胞脂肪合成影响的研究基本一致。本试验为研究FA对乳脂肪合成调控提供一定的实验基础，为反刍动物乳脂肪的营养调控提供理论依据。