投饲频率干预后军曹鱼对添加外源蛋氨酸饲料的利用效果

■迟淑艳 谭北平 杨奇慧 董晓慧 刘泓宇 章 双

（广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088）

晶体氨基酸（CAA）用于商业饲料中满足动物必需氨基酸的需要已经有40多年的历史[1]，不仅满足机体蛋白质的合成和生长，还决定饲料的可接受性[2]。然而有研究表明，鱼类对CAA和蛋白来源的氨基酸(PAA)在吸收速度上存在差异，前者在肠道的吸收快于后者而影响了体内氨基酸的平衡，更多的氨基酸被分解而不是参与蛋白质沉积，因而弱化了CAA的利用效果[3-6]。微胶囊氨基酸具备缓释作用可以延缓蛋氨酸在肠道中的释放，对CAA的吸收有改善作用。同时，通过投饲频率干预可以调控机体内游离氨基酸所出现的这种不平衡。Batterham发现猪可以通过改变投饲频率（1～6次/d）改善CAA在消化道中出现峰值的时间，与PAA达到同步吸收，从而更有效地利用外源赖氨酸满足生长[7]。本试验拟通过投饲频率干预，研究投喂次数的增加是否可以改善军曹鱼（Rachycentrron canadum Linnaeus）幼鱼对外源蛋氨酸的利用效果。

1.材料与方法

1.1 试验饲料

配制等氮、等脂的基础饲料（见表1），分别添加晶体蛋氨酸（MET）和微胶囊蛋氨酸(采用树脂包被蛋氨酸，RES)。所有原料经粉碎后过60目筛，按表1饲料配方混合均匀，经双螺杆制粒机[F-26(Ⅱ)，华南理工大学科技实业总厂]挤压成直径2 mm的柱状，在60℃恒温下干燥1 h，阴干后破碎，置-20℃冰箱备用。

1.2 饲养管理

养殖试验在广东恒兴集团国家“863”计划海水养殖种子工程南方基地进行。试验用军曹鱼鱼苗经商业饲料（台湾全兴饲料）驯化两周后进行分组。每个处理3个重复，每个重复放养20尾鱼[初始重(5.40±0.07)g]于500 L玻璃钢养殖桶中。养殖期间，24 h供氧，盐度30～34 g/l，溶解氧8～8.5 mg/l，水温29～31 ℃，pH值7.8～8.0，养殖试验持续30 d。投饲频率分别为2、3、4和5次（见表2），每个处理摄食率保持一致。

1.3 样品收集及化学分析

饲养试验结束时，禁饲24 h，对每个重复的鱼进行称重，随机选取3尾测定体长、体重后放入-20℃冰箱保存供测体成分；随机选取5尾取胃、肝脏和肠道，放入-80℃冰箱保存供测酶活性。试验饲料、全鱼常规成分分析参考AOAC方法[8]。其中，水分的测定为105℃烘干恒重法；粗蛋白的测定为凯氏定氮法（N×6.25，FOSS Kjeltec System 2300，Sweden），脂肪的测定为索氏抽提法（Extraction System B-811，BÜCHI Labortechnik AG，Switzerland）；粗灰分的测定为箱式电阻炉550℃灼烧法。

表1 饲料配方

表2 投饲频率和投喂时间

取样胃、肝和肠，预冷的双蒸水冲洗干净后，用预冷的磷酸缓冲液（pH值7.8）10 000×g离心，取上清液制成1%的匀浆，测定胃蛋白酶（Pepsin）、胰蛋白酶(Trypsin)、总蛋白酶(T-protease)和淀粉酶(Amylase)。

胰蛋白酶活性测定[9]：将N-苯甲酰-L-Arg乙酯（BAEE）溶于含有氯化钙的 Tris-Hcl（pH值7.6）缓冲液中，25℃水浴下进行反应，立即混合，253 nm波长读取吸光度，每隔1 min读取吸光度，连续5 min，直至每分钟吸光度增大值达恒定为止。活力单位定义为以BAEE为底物，反应液pH值7.6，25℃，反应体积3.0 ml，光径1 cm的条件下，测定△A253nm，每分钟使△A253nm增加0.001，反应液中所增加的酶量为一个BAEE单位。胰蛋白酶酶活力计算：

式中：△A253nm——每分钟内253 nm处吸光度增大值(=△A样/分-△A空/分)；

0.001——一个酶单位每分钟吸光度增大0.001；

0.2 ml——酶液体积。

淀粉酶活性测定[10]：以可溶性淀粉为底物，采用碘-淀粉法，在660 nm波长下测吸光度，活力单位定义为100 ml血清中的淀粉酶，在37℃，15 min水解5 mg淀粉为1个单位。

肝脏总蛋白酶(T-protease)活性测定[11]：以偶氮酪蛋白（azozasein）为底物，10 μl酶液加入含有1.5%偶氮酪蛋白的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH值7.5），25℃下反应10 min，加入0.5 ml 20%三氯乙酸终止反应，混合物在6 500×g离心5 min，上清液在366 nm下测吸光度。

比活力（U/mg·pro）=酶活力/蛋白含量（mg/ml），组织蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法[12]。

1.4 生产性能指标计算

增重率(WG，%)=（Wt-W0）/W0×100；

特定生长率(SGR，%/d)=(lnWt-lnW0)/d×100；

蛋白质效率(PER，%)=（Wt-W0）/(Wi×Pf)×100；

饲料系数(FCR)=Wi/(Wt-W0)；

肥满度(CF，g/cm3)=Wb/L3；

肝体比(hepatosomatic indexs，HIS)=Wl/Wb×100。

式中：Wt——终末体重（g）；

W0——初始体重（g）；

Pf——饲料粗蛋白含量（%）；

Wi——摄食饲料干重（g）；

Wl——肝脏重量（g）；

Wb——每尾鱼体重（g）；

L——体长（cm）。

1.5 数据分析

试验数据采用单因素方差分析(ANOVA)，用LSD检验法进行均值间多重比较。统计分析所用的软件为SPSS 11.5。

2 结果

2.1 投饲频率对军曹鱼幼鱼生长性能的影响(见表3)

表3 投饲频率对军曹鱼幼鱼生长性能的影响

由表3可知，各试验组的成活率在96.67%～100%之间，投饲频率干预未对成活率产生显著影响（P＞0.05）。随投饲频率的增加各试验组WG增加，各投饲频率下，RES组WG均高于MET组，投喂5次时，RES组WG显著高于其余各组（P＜0.05）。在投喂5次时，RES组SGR显著高于MET组（P＜0.05）。RES组在投喂3次时HIS显著高于其他各组（P＜0.05），之后随投喂次数的增加而下降；MET组日投喂3次和5次的CF显著高于投喂2次的组（P＜0.05），RES组日投喂5次的CF显著高于投喂3次的（P＜0.05）。

2.2 投饲频率对军曹鱼幼鱼体成分的影响（见表4）

MET组和RES组全鱼粗蛋白随各自投喂次数的增加各自未呈现显著性差异（P＞0.05），投喂5次时RES组粗蛋白含量显著低于MET组（P＜0.05）；RES组粗脂肪含量随投喂次数的增加而上升，但到5次时下降，4次时RES组粗脂肪显著高于相同次数的MET组（P＜0.05）。

2.3 投饲频率对军曹鱼幼鱼消化酶活性的影响（见表5、表6）

表4 投饲频率对军曹鱼幼鱼全鱼营养成分的影响(%干重)

表6 投饲频率对军曹鱼幼鱼肝脏消化酶活性的影响（U/mg·pro）

试验结果表明，MET组肠道的胰蛋白酶活性随着投喂次数的增加有所下降，但在投喂5次时有所回升，显著高于投喂4次的组（P＜0.05）；RES组肠道胰蛋白酶活性则在投喂3次时显著高于其他各组（P＜0.05）；RES组肠道淀粉酶活性在投喂3次时显著高于其在2次、4次和5次的处理组（P＜0.05），投喂5次时，MET组淀粉酶活性显著高于RES组（P＜0.05）；投喂5次的RES组胃蛋白酶活性显著低于其他各组（P＜0.05），MET组胃蛋白酶在投喂2次时活性显著高于投喂次数相同的RES组和投喂5次的处理组（P＜0.05）。

表6显示，MET组在投喂2次时肝脏胰蛋白酶活性较高，但是随着投喂次数的增加有所下降，在投喂5次时有所回升（P＞0.05），RES组肝脏胰蛋白酶活性投喂4次时显著高于其他各组（P＜0.05）；投喂次数增加肝脏总蛋白酶活性呈先增后降，投喂3次的MET组肝脏的总蛋白酶显著高于其他各组（P＜0.05）；肝脏淀粉酶活性随投喂次数的增加而上升，5次投喂的MET组显著高于3次投喂组和2次投喂的RES组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 投饲频率对军曹鱼幼鱼生长性能的影响

投饲频率是影响营养物质代谢的重要因素[13]，关系到鱼类生长、饲料转化率、鱼体规格和鱼体代谢废物等方面[14-16]。本试验中当投饲频率从日投喂2次增加到5次时，晶体蛋氨酸MET组的WG呈上升趋势，但是差异不显著，但是，投喂5次可以显著提高微胶囊蛋氨酸RES组的WG，该组的PER和SGR也有相似变化趋势。Zarate等认为，若投饲频率从日投喂2次增加到5次时，晶体赖氨酸和蛋白结合态赖氨酸对斑点叉尾鮰的生长没有产生显著影响；当不考虑赖氨酸来源时，日投喂5次时斑点叉尾鮰的生长优于日投喂2次实验组[17]。本试验结果表明，不考虑蛋氨酸来源，随着投饲频率的增加，WG增加。在低鱼粉蛋白饲料中添加CAA，可能会比豆粕蛋白中释放出来的氨基酸更快速吸收[18]。增加投饲频率可以改善金头鲷（Sparus aurata Linnaeus）[2]和鲤鱼[19]对 CAA的利用率。因此，CAA在消化道中吸收速度快于PAA，导致分解代谢升高，合成代谢降低[20]。由于水生动物贮存游离氨基酸的能力甚低，导致先吸收的CAA不能用于合成蛋白质(PAA尚未被吸收)而直接排泄或代谢；缩短投饲间隔后，可以使前次投饲时所产生的血液氨基酸依然保持在一个较高的水平而后一次投饲产生的血液氨基酸峰值可与前次产生一定程度的叠加，使CAA与其他来源于饲料PAA产生一定的互补，以便于氨基酸池达平衡满足蛋白质的合成，从而显示出改善CAA的作用效果[21]。冷向军等的研究表明，日投饲频率为2次和3次时，低蛋白饲料中补充的晶体赖氨酸和蛋氨酸对异育银鲫的生长并无改善作用；但当投饲频率增加到4次后，异育银鲫的生长得到显著改善，较不添加CAA的低蛋白对照组提高增重率12.5%[21]。

Batterham等认为，日投喂1次时，豆粕中蛋白结合态赖氨酸比游离赖氨酸更能够促进猪的生长，但是当日投喂6次时生长性能不受赖氨酸形式的影响，也就是说在豆粕为主要蛋白源时，投喂次数的增加改善了游离赖氨酸的利用[7]。用不同蛋白源（豆粕、血粉、肉骨粉等）替代鱼粉，同时补充CAA后饲喂斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)，从表观消化率的数值表现出CAA比PAA有更高的利用率，但是游离氨基酸的效率受到蛋白源的限制[19]。本试验中蛋白源除了豆粕外主要添加了肉骨粉。豆粕和肉骨粉都是蛋氨酸缺乏的饲料原料，其整体成分中某种或某些成分可能是影响蛋氨酸利用的因素之一，但是具体机制不清楚。

3.2 投饲频率对军曹鱼幼鱼体成分的影响

投饲频率（日投喂2次和5次）对斑点叉尾鮰体成分含量没有产生显著影响[17]，欧洲螯龙虾（Homarus gammarus L.）蛋白质的合成和降解率没有受到投饲频率（1次/2 d、1次/4 d和1次/1 d）的影响[22]。然而，有研究表明，投饲频率的增加显著增加了大黄鱼仔鱼粗蛋白和粗脂肪含量[23]，黑鲷成鱼和鱼种的水分含量随饲喂频率的增高而增加，成鱼脂肪含量随饲喂频率的增高而下降，鱼种脂肪含量随饲喂频率的增高而增加[24]，投喂5次的虹鳟体蛋白质显著高于投喂1次的，而脂肪的含量则显著低于投喂1次的[3]。增加投饲频率有利于养分的沉积，在本试验中，投喂5次的MET组全鱼粗蛋白含量显著高于投喂4次和5次的RES组，投喂2次和3次的粗蛋白含量没有受到显著影响；日投喂4次的RES组粗脂肪显著高于MET组。提示投喂5次时CAA与PAA的吸收相协调，能够促进蛋白质的沉积。

3.3 投饲频率对军曹鱼幼鱼消化酶活性的影响

本试验中，军曹鱼幼鱼胃蛋白酶活性在投喂2次时，MET组显著高于RES组和投喂5次的处理组。饲料中的蛋白质在胃部低pH值的条件下经胃蛋白酶作用初步降解，因此试验中胃蛋白酶的变化可能主要由投饲频率所引起。Rolls等（1972）研究表明，CAA比蛋白质和肽更快速的通过老鼠的胃[25]，由于投饲频率与胃排空的时间紧密相关[26-27]，随投饲频率增加可能刺激了胃排空速度加快，使食物消化不充分而导致投饲频率增加胃蛋白酶活性下降。

较低或较高的投饲频率会降低团头鲂肠道消化酶活性[28]。大黄鱼仔鱼肝脏和肠道胰蛋白酶活性在投饲频率由2次/d上升到8次/d时是显著上升的，当投饲频率由8次/d上升到12次/d时，胰蛋白酶活性维持恒定[23]。本试验中RES组在日投喂3次时肠道胰蛋白酶活性显著高于其他各组，而MET组则在日投喂5次时肠道胰蛋白酶活性达最高，肝脏总蛋白酶活性以投喂3次的MET组最高，可能与蛋氨酸在肠道中的释放速度有关。MET和RES两种蛋氨酸形式在肠道释放速度是不同的，在不同的投饲频率下，在某个特定时间恰好与其天然的有关消化和/或代谢酶的分泌、发挥作用或者合成的节律一致，酶的分泌和蛋白质分解、蛋氨酸释放以及蛋氨酸和PAA释放的速度相吻合的程度恰好一致，有助于蛋白质的分解利用[2]。本试验中WG和PER的变化和胰蛋白酶的变化趋势并不一致。蛋白酶包括较多种，并且蛋白酶的分泌受到动物种类、饲料种类和投饲策略等因素影响。欧洲鲈鱼肠道蛋白酶的活性属于随昼夜差异而变化的酶，不管投饲频率如何其活性只在晚上才增加[29]。食糜在消化道停留的时间也会影响消化酶的作用，随着投饲频率增加，消耗的饲料也随之增多，每次摄食的时间间隔变短时，食物通过消化道的速度加快，导致消化效果下降[30]。

4 结论

综上所述，增加投饲频率可以改善军曹鱼幼鱼的生长性能和消化酶活性，促进饲料中外源蛋氨酸的利用。投喂5次有利于晶体蛋氨酸对蛋白质沉积作用的促进，RES微胶囊蛋氨酸本身对蛋氨酸具有缓释作用。投饲频率的增加会导致摄饵行为增加，进而体力和内分泌组织的活动增大，导致生长和饲料转化率下降。通过本次试验表明不同时间点军曹鱼对氨基酸的存在时间的差异，对进一步改善微胶囊技术，定点释放或缓慢释放有一定的指导意义。从配方的角度入手，调整配方蛋白源的搭配、或者根据养殖对象在多次投喂所表现出来的生长特性对氨基酸的包被技术进一步改进，增加壁材厚度延长其释放时间或定点释放等，改善外源氨基酸的利用效果。