壳聚糖在喉软骨组织工程中的应用

崔 翔 侯瑞霞 李 群 陆达楷 邓红霞 沈志森

壳聚糖在喉软骨组织工程中的应用

崔 翔 侯瑞霞 李 群 陆达楷 邓红霞 沈志森

喉癌、喉狭窄、外伤等引起的喉软骨缺损是耳鼻咽喉科常见的损伤，喉软骨的修复重建是临床面临的重大挑战。软骨因无血管和淋巴，自身修复及再生能力差，目前尚未能重建出持久的喉软骨组织来替代受损的喉软骨。组织工程的兴起给喉软骨重建带来新的契机，其关键在于设计合适的支架材料以负载种子细胞和生长因子，促进喉软骨再生，以实现喉软骨修复重建。壳聚糖材料具有良好的生物相容性，可诱导软骨细胞附着、增殖，易于塑形，生物降解速率可调控，已广泛应用于组织工程研究。本文总结了喉软骨的结构特点、壳聚糖的特性，以及壳聚糖在软骨组织工程中的应用，以探索壳聚糖在喉软骨组织工程中应用的可能性。

壳聚糖喉软骨组织工程支架材料

喉是人体十分关键的部位，结构精巧且复杂，包含有甲状软骨、会厌软骨、环状软骨、杓状软骨、舌骨等多种软骨组织，聚集在咽喉狭小的通道中，提供并维持着喉腔的力学支撑。临床上喉肿瘤、喉创伤、喉先天性畸形等疾病，通常以喉切除术等手术进行治疗。这些不可避免的喉软骨损伤及切除会带来诸如失音、嗅觉变化、容貌改变，甚至永久性气管造瘘等一系列问题，严重影响患者的生理和心理健康[1]。因此，喉功能最大限度的保留与重建，是临床亟待解决又充满挑战的课题。20年来已进行了许多尝试，如采用喉内显微激光技术来保留喉功能[2]，适用于早期喉癌（T1和T42阶段）的手术切除；此外，甲状软骨与气管一期吻合术因不影响喉和气管的正常生长发育，成为解决声门下喉气管损伤的有效手段。Grillo等[3]在完全切除环状软骨环和部分后壁的环状软骨板后，完成了初步的气管-甲状软骨吻合，环状软骨满意地被环行的软骨气管所替代。但以上方法均只能在一定程度和范围内保留喉软骨的功能，并未通过修复和重建喉软骨来保留喉的功能，因此构建具有高度仿生结构与功能的喉软骨具有重要的临床价值和社会价值。

近年来，组织工程的兴起给喉软骨的修复重建带来新的思路和希望。通过构建类似细胞外基质的组织工程支架，与细胞、生长因子等活性物质结合，通过体外培养和体内植入，促使新组织再生，达到修复和重建病损组织的目的。其中，组织工程支架材料的选择及其结构与功能的调控尤为重要。许多天然和人工合成材料已被广泛应用于软骨的修复及重建研究。壳聚糖作为独特的天然材料已在生物医用材料领域得到广泛应用，包括人工皮肤、可吸收缝线、止血海绵、防黏连剂/膜及降压、降胆固醇制剂等。在药物传递、DNA的载运、神经的重塑、肿瘤靶向治疗等方面，壳聚糖也发挥了巨大作用。在组织工程学领域，壳聚糖已成为非常重要的组织工程支架材料，被广泛地应用于骨与软骨组织工程的研究，并越来越多地受到重视。本文通过总结喉软骨的结构特点，归纳壳聚糖的特性和壳聚糖在软骨组织工程中的应用，以探索其在喉软骨组织工程中应用的可能。

1 喉软骨的结构及其修复

1.1 软骨成分及结构

软骨属结缔组织范畴，是人和脊椎动物特有的胚胎性骨骼，由软骨细胞、软骨膜及基质构成。软骨根据基质中所含纤维成分不同可分为透明软骨、纤维软骨和弹性软骨，在机体内起支持和保护作用。从成分组成的角度研究，软骨由液相和固相组成，液相主要是水，固相包括胶原纤维或弹性纤维、蛋白多糖和细胞成分。液相主要功能是通过自身的媒介作用把小的溶质传送或扩散于组织内外；固相的蛋白多糖和纤维构成的网状支架则是构成天然软骨支架的主要成分，提供着主要的力学支撑。软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞成分，属于终末分化细胞，增殖能力有限，并且包埋于由胶原和蛋白多糖组成的软骨陷窝内，无法自由移动，软骨全层或部分损伤很难通过软骨细胞增殖进行修复[4-5]，此外软骨中缺乏血管，无法通过血液来运输组织修复所需的养分。因此，软骨细胞一旦损伤或缺失，极难通过自身修复来愈合。

透明软骨基质中的主要成分是蛋白多糖和胶原[6]。胶原种类包括Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ、和Ⅺ型胶原，其中Ⅱ型胶原占90%～95%，是透明软骨基质中的主要特征性胶原。蛋白多糖包含95%氨基葡聚糖和5%蛋白质。氨基葡聚糖具有很强的吸纳、释放自由水的能力，使得软骨具有良好的弹力和应力。蛋白多糖分子的侧链以短突形式与Ⅱ型胶原为主的胶原纤维相接触，构成较大间隙的网架，以承受压力并结合大量的水分子构成稳固的软骨细胞外基质框架和微环境，从而有助于基质和软骨细胞相互作用。

1.2 喉软骨结构

喉部的软骨组成包括单一的甲状软骨、环状软骨、会厌软骨和成对的杓状软骨。其中，透明软骨位于甲状软骨、环状软骨和杓状软骨的大部分，而弹性软骨位于会厌软骨、甲状软骨中央部、杓状软骨的声带突和尖、籽状软骨。甲状软骨是喉软骨中最大的一块，由两块前缘相互融合的近似四边形的软骨板组成，构成喉的前壁和侧壁。环状软骨位于甲状软骨下方，由前部窄而低的环状软骨弓和后部高而宽阔的环状软骨板组成，是喉部唯一完整环形的软骨，对于支撑呼吸道保持其通畅特别重要。会厌软骨上宽下窄，下端狭细的会厌软骨茎借韧带连于甲状软骨前角内面，防止食物误入喉腔。杓状软骨位于环状软骨板后上缘，呈三角锥形，左右各一，顶尖向后内方倾斜，其底部和环状软骨连接成环杓关节。可见喉形态复杂，呈管状中空结构，腔隙不规则，有棱有角，且各关节连接精细。因此，组织工程模拟喉软骨形态有一定的难度，三维打印技术的应用有望解决这一难题。

1.3 目前常用的软骨修复方法

自体软骨移植具有成骨能力强、无免疫排斥反应、容易愈合等特点，是一种较为安全的方法。喉软骨修复可取材于鼻中隔软骨、肋软骨[7]、甲状软骨[8]、舌骨[9]、耳软骨[10]等。肋软骨因其强度能防止内部坍塌，弹性允许与周围的组织协同移动，且往往不被吸收，非常适合于喉软骨的修复。采用自体肋软骨进行延迟喉气管重建，仍然是临床上声门下狭窄的标准治疗。此外，Cansiz等[11]把复合鼻中隔移植用于喉气管肿瘤切除后的重建，平均62个月的随访期间无局部复发和并发症。Bhavana等[12]报告了两例用髂嵴作为喉气管移植物来进行声门下喉重建。但自体软骨移植取材来源有限，附加供区损伤，供区并发症可能和离体组织缺血坏死的可能[13]均使其临床应用受到限制。

同种异体软骨移植治疗软骨损伤是另一种可行的方法。因可根据损伤的情况任意设计移植物的大小及形状，这种方法对不同解剖部位及不同大小的软骨损伤均适合，尤其是损伤面积在2 cm2以上伴有软骨下骨缺损时更能够显示其优势。Smith等[14]报告了经过射线处理的异体肋软骨移植治疗小儿轻度声门下狭窄，成功代替了自体移植，减少了手术时间，降低了术后并发症发生率。Ma等[15]通过灌注法去掉喉肌群及黏膜等高免疫原性物质，保持喉肌群中细胞外基质三维空间结构，从而保留了完整的软骨支架结构和软骨细胞活性。林文彪等[16]探讨了鼻内镜下同种异体鼻中隔软骨移植术，在鼻中隔穿孔修补中的疗效，结果15例穿孔Ⅰ期愈合，1例Ⅱ期愈合，随访1～3年，16例患者均无穿孔复发及不良反应，有效率达100%。然而，目前的研究对于同种异体骨植入后的愈合机制、免疫反应等问题的阐释尚未明确，如何来保存软骨组织以求在安全前提下最大程度地降低其免疫原性，并加快植入后的骨愈合速度等方面亦存在争议。

1.4 软骨组织工程的基本特征

组织工程是一门新兴的涉及种子细胞、支架材料以及生长因子，来构建人造组织或器官的跨领域学科。软骨组织工程的核心就是将软骨细胞或有分化增殖潜能的干细胞，混合接种在多孔的三维支架或者水凝胶上。支架材料在这一过程中不仅起着支撑作用，保持原有组织的形状，而且还起到模板作用，为细胞提供赖以寄宿、成长、分化和增殖的场所，并引导受损组织的再生和可控再生。所以，支架材料必须能模拟软骨细胞外基质的环境，为新组织的形成提供合适的微环境[17]。理想的软骨组织工程支架必须具备的条件：①具有一定的三维多孔结构，利于软骨细胞生长及营养物质和代谢废物的运输和排泄；②具有可生物降解或可生物再吸收的特性，材料的降解或吸收，能匹配软骨组织的生长速率，并且不释放有细胞毒性的降解产物；③能支持种子细胞的黏附、增殖和分化；④作为临时支架，能在移植部位提供足够的机械强度；⑤能被塑造成各种临床要求的软骨形状和尺寸。

2 壳聚糖的特性以及其在软骨组织工程中的应用

2.1 壳聚糖的理化特性

壳聚糖是自然界中仅次于纤维的第二大生物多糖，是甲壳素部分脱乙酰基后的产物，甲壳素广泛存在于昆虫和海洋无脊椎动物的外骨骼上。作为生物材料，壳聚糖来源广泛、取材方便。由于聚合程度的不同，分子量界于50～1 000 KD；溶解性与pH值密切相关，当pH＜5时，壳聚糖能完全溶于稀酸溶液中，形成黏稠的溶液。壳聚糖是一种带正电荷的阳离子碱性聚合物，分子上的NH3+基团易与带负电荷的阴离子聚合物相互作用。因此，壳聚糖与一些水溶性的具有生物活性的阴离子聚合物，如GAGs、DNA、肝素等，能形成电解质复合物水溶液。壳聚糖的降解产物为葡萄糖胺或者N-乙酰基-D葡萄糖胺，这些降解产物或与糖蛋白结合，或以二氧化碳的形式排出体外，对人体无毒害作用。此外，壳聚糖还能与众多电荷基团，如烃烷基、硫酸根结合，产生具有新特性的衍生物，并可通过修饰其侧链基团，来赋予新的化学衍生物以新的生物活性[18]。因此，通过化学改性的方法，可设计出各种性能的壳聚糖衍生物用于组织工程材料[19-21]。

2.2 壳聚糖的生物活性

壳聚糖是一种由β(l,4)糖苷键相连的葡萄糖胺和N-乙酰基-D葡萄糖胺的线性天然聚合物。而N-乙酰基-D葡萄糖胺基团还存在于软骨的细胞外基质成分中，因此壳聚糖与软骨组织有着良好的相容性，壳聚糖支架植入缺损区一般只会引起很小的排斥反应，并能通过与某些生长因子相互作用的方式，实现损伤部位的原位治疗[22]。活体实验显示，在植入早期（＜7 d），移植物周围有较多中性粒细胞聚集，但很快消散，不会引起慢性炎症也无大量纤维组织增生[23]。此外，有研究表明，壳聚糖对种子细胞的分化与生长也有较明显的诱导促进作用。目前，软骨组织工程的种子细胞主要为软骨细胞和干细胞，种子细胞的培养经历两个阶段：第一阶段的种子细胞以扩增数量为主，第二阶段的细胞需要诱导其特定的软骨表型。而大多数细胞在第一阶段时已丧失了分泌细胞外基质的能力[24]，因此需要添加诸如FGF-2和TGF-b等生长因子来维持这一能力，而壳聚糖具有出色的软骨诱导能力。壳聚糖已被证明能诱导hBMSC向成软骨定向分化，并促进其黏附、扩散和存活[25]。壳聚糖具有维持软骨细胞形态和分泌细胞外基质的能力。Lahiji等[26]的实验表明，壳聚糖能够促进软骨细胞的黏附和增殖，并促进软骨细胞合成与分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖。诸多研究已表明，壳聚糖优异的生物活性能基本满足软骨组织工程对材料生物学特性的要求。

2.3 壳聚糖支架的制备

壳聚糖易被加工制作成多孔支架结构，是壳聚糖在细胞移植和组织修复方面的另一个优势[27]。壳聚糖上诸多的NH3+和OH-，使得壳聚糖能与许多离子进行化学交联。目前，已有多种壳聚糖支架通过化学或物理交联方法制备出来，用聚乳酸和壳聚糖为材料以相分离法制备了复合支架用以软骨缺损修复，并用脂肪干细胞（ASC）作为种子细胞植入兔子体内培养12周后发现支架能有效地支持ASC的依附、扩散和分化，支架的弹性模量能达到兔子相应膝关节软骨模量的83%，达到了0.69±0.11 MPa[28]。王玉等[29]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料，采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架。发现软骨细胞外基质/壳聚糖复合支架具有疏松多孔结构，孔隙率为90.15%，MTT结果显示支架无细胞毒性，诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好。Hoemann等[30]用壳聚糖/甘油磷酸钠温敏水凝胶对复合软骨细胞的软骨细胞外基质进行培养，结果发现软骨细胞在支架中生长良好。Chen等[31]制备了温敏性壳聚糖-g-PNIPAM凝胶和透明质酸/壳聚糖-g-PNIPAM，通过SEM研究该凝胶对软骨细胞生长的作用，结果表明，在这种凝胶体系上培养的软骨细胞能很好生长和增殖。Li等[32]用聚L-丙交酯-co-己内酯与壳聚糖交联来模拟软骨的主要生化成分，发现支架不仅可以促进细胞黏附和增殖，而且可以显著提高废物的代谢以及Ⅱ型胶原蛋白的分泌，力学性能也有所提高。Mwale等[33]用5%的京尼平与壳聚糖交联形成水凝胶，被认为是一种很有前途的水凝胶。文献认为，丝素蛋白和壳聚糖1∶1配比形成的支架，相比单独的成分，表现出更高的压缩强度和弹性模量，并能支持软骨细胞附着、增长和软骨化表型[34-35]。此外，还有一些研究文献指出，壳聚糖的细胞亲和力可以通过对其改性或与其他材料复合来进一步提高，更有利于细胞的黏附与增殖。有报道将壳聚糖与其他细胞亲和性好的材料复合，制备新型生物材料，如壳聚糖/Ⅰ型胶原，壳聚糖/Ⅱ型胶原，壳聚糖/明胶以及壳聚糖/透明质酸等复合支架，应用于软骨组织工程。

软骨组织工程支架在体内的降解速率，是另外一个关注点。关于兔模型软骨组织工程修复的研究显示，新的软骨再生时间一般为8～16周不等，但绝大多数研究在12周以后才显示出更好的再生效果。壳聚糖主要被体液里的溶菌酶降解，完全降解需要数月之久，Tomihata等[36]证明，84%脱乙酰度壳聚糖浸在4 mg/mL溶菌酶中50 h只降解了10%，因此可通过壳聚糖与降解速率快的材料复合来提高降解速率。史德海等[37]用冷冻干燥法制成了单纯的壳聚糖支架及壳聚糖-Ⅱ型胶原复合支架，用含有溶菌酶的PBS液浸泡，置于37℃水浴中进行降解实验，结果发现胶原复合的支架相比单纯壳聚糖支架降解率从12周的30%提升到50%左右。研究表明，壳聚糖被溶菌酶降解的速率和壳聚糖的脱乙酰化程度及pH相关，壳聚糖在pH为4.5时，其降解速率是pH为7时的5倍。因此，我们有望通过改变壳聚糖乙酰化程度和pH值，来设计出拥有合理吸收和降解速率的壳聚糖支架。壳聚糖复合材料孔隙的大小，与细胞黏附生长的关系也十分密切。喉部环状软骨的扫描电镜结果显示，软骨陷窝内椭圆形软骨细胞直径在5～10 μm左右，而软骨陷窝的大小则在30～50 μm不等。因此，支架孔隙大小必须在50 μm以上，过小的孔隙会引起孔的闭塞，从而阻止细胞在支架内的渗透和天然软骨陷窝的生成。此外，Bhardwaj等[38]研究发现，壳聚糖与蚕丝蛋白的复合支架的孔隙直径为100±11 μm时最适合软骨细胞的生长，当然孔隙率越大，支架含水率越高，越有利于养分在支架内的流通。Kuo等[39]制成的羟磷灰石/甲壳素/壳聚糖复合支架，孔隙率达250 μm，透明软骨细胞在支架表面仍能很好地生长。但过大的孔隙率势必会带来材料强度的降低，在合适的孔隙大小与材料力学强度中取得良好的平衡点，是壳聚糖运用于软骨支架时亟须解决的问题。

2.4 壳聚糖在喉软骨应用的特性与要求

喉软骨组织工程的支架材料不仅要符合组织工程一般材料的要求（良好的生物相容性、生物可降解性、三维多孔材料和一定的力学强度等），还必须具备以下特点：能够维持细胞的形态和表型，促进细胞的黏附和增殖，诱导软骨组织的形成；材料的降解速率必须与喉软骨再生速率相匹配；可以在一定的压力下保持其原有结构；其强度要适中，既能够满足局部负荷的要求，又不至于产生应力遮挡作用，从而在外力作用下促进软骨细胞分泌软骨基质，逐渐形成新生软骨并取代支架材料；需要材料有着良好的塑形性，能模拟各种形状来满足喉软骨各种独特的三维结构要求。壳聚糖可调控的生物降解率，良好的塑形性及可加工性，诱导软骨细胞黏附、增殖的能力都能满足喉软骨组织的要求，而作为天然高分子材料，其力学强度的欠缺在一定范围内限制了其应用和推广。对喉软骨中的环状软骨的力学性能的相关研究显示，新鲜人环状软骨的压缩强度约为3.57±0.64 MPa，弹性模量可达4.06±1.25 MPa。Li等[40]用原位沉析法制成了三维有序壳聚糖支架，当壳聚糖浓度6%，烘干时间定为90 min时，压缩力学强度可达到1.8 MPa，孔隙率也能维持在80%以上，已经十分接近环状软骨的力学强度，是一种很有前景的喉软骨组织工程材料。此外，壳聚糖具有广谱抗菌性和良好的止血能力，能有效防止术后炎症反应的发生和降低出血的可能性，提高手术的预后效果，为壳聚糖应用于临床带来了方便。

3 总结与展望

综上所述，临床上常使用的自体软骨及同种异体软骨移植重建喉软骨，虽有一定疗效，但有局限性。组织工程技术的兴起给喉软骨修复带来了新的希望。壳聚糖作为一种天然生物材料，已被广泛应用于软骨组织修复的体外及活体研究。壳聚糖来源广泛，价格便宜，拥有良好的生物相容性、塑形性、软骨诱导性和降解可调控性，被证实在软骨组织工程领域有很好的应用价值和可行性。从现有研究看，单一的壳聚糖成分支架已不能满足要求，制备良好性能的壳聚糖复合支架，并调整复合材料中各单体比例还需要进一步探索。此外，克服现有壳聚糖支架存在的力学性能不足的缺点也是需要研究解决的问题。目前，研究的热点大多集中于关节软骨修复，运用于喉软骨修复损伤的探索和研究相对较少，设计出合适的壳聚糖支架以满足喉软骨特征性的修复，仍需积极探索。基因工程与组织工程的联合运用，使得壳聚糖修复喉软骨的治疗前景更加广阔。

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Application of Chitosan in Laryngeal Cartilage Tissue Engineering

CUI Xiang1,3,HOU Ruixiang3,LI Qun1,2,LU Dakai1,2, DENG Hongxia2,SHEN Zhiseng1,2,3.
1 NingBo University School of Medicine,Ningbo 315211,China;2 Li Huili Hospital,NingBo University School of Medicine,Ningbo 315211,China;3 Ningbo Material Technology and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences,Ningbo 315211,China.Corresponding author:SHENG Zhiseng(E-mail:szs7216@163.com).

【Summary】The repair and reconstruction of laryngeal cartilage defects caused by laryngeal cancer,stenosis,trauma is a major challenge of the Otolaryngology.Due to the absence of blood vessel and lymph,the cartilage has poor ability to repair or regenerate itself once damaged.Little is reported on the enduring cartilaginous tissue to replace damaged laryngeal cartilages.The rise of tissue engineering offers new opportunities for laryngeal cartilage reconstruction.It is critical to develop appropriate scaffold materials to support cell adhesion,proliferation and neocartilage regeneration so as to repair laryngeal cartilage.Chitosan possesses excellent biocompatibility,the ability to induce chondrocyte adhesion,proliferation and differentiation,flexibility to process,and controllable biodegradation rate.It has been one of the most prom ising biomaterials for cartilage tissue engineering.However,little has been reported on the application of chitosan in the laryngeal cartilage tissue engineering.This review summarized the characteristics of laryngeal cartilage and updated chitosan-based materials for cartilage tissue engineering.Based on these,possible application of chitosan based materials for the laryngeal cartilage tissue engineering was discussed.

Chitosan;Laryngeal cartilage;Tissue engineering;Scaffold

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.026

Q813.1+2

B

1673－0364（2015）03－0208－05

宁波市重大择优委托项目（2012C5015）；宁波市自然科学基金（2012A610208，2012A610217）；浙江省医药卫生科技计划项目（2012ZDA042）。

315211浙江省宁波市宁波大学医学院（崔翔，李群，陆达楷，沈志森）；315000浙江省宁波市宁波大学医学院附属李惠利医院（李群，陆达楷，邓红霞，沈志森）；315201浙江省宁波市中国科学院宁波材料技术与工程研究所（崔翔，侯瑞霞，沈志森）。

沈志森（E-mail：szs7216@163.com）。