裂褶菌子实体中多糖及蛋白质含量的测定

孙鹏珍+刘月+王大可+李爱欣+王淑敏

[摘要]目的 建立裂褶菌子实体中多糖、蛋白质含量的测定方法。 方法 采用分光光度法测定多糖和总蛋白含量，检测波长分别为479nm和595nm。 结果 多糖浓度在0.012～0.040mg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子实体多糖含量为7.26%；蛋白浓度在0.0078～0.0321mg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，子实体总蛋白含量为0.2631%。 结论 本研究建立的方法简便、快速、准确，重复性好，为裂褶菌子实体多糖和蛋白质含量的测定提供了依据。

[关键词] 裂褶菌；多糖；蛋白质；含量测定

[中图分类号] TQ461 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）23-74-04

裂褶菌（Schizophyllum commne Fr.）又称白参、树花、八担柴，隶属于真菌门（Eumycophyta），担子菌纲（Basidiomycetes），伞菌目（Agaricales），裂褶菌科（Schizophyllaceae），裂褶菌属（Schizophyllum），食用有滋补、强身的作用[1]。近年来，日本及欧美等国在分子生物学、抗癌活性物质和优良菌株的选育等方面进行了广泛的研究[2-4]，我国李梦杰等[5]对其培养研究并分离出了产漆酶的裂褶菌GGHN08-104菌株。裂褶菌子实体中含有多种活性成分，郭孟璧等[6]对裂褶菌挥发油的化学成分进行了研究，结果鉴定出（Z，Z） -9，12-十八二烯酸等12种化学成分，毛绍春等[7]用硅胶柱反复层析从子实体中分离出了麦角甾醇等多种化合物。药用真菌目前研究最多的是真菌多糖，裂褶菌多糖可增强巨噬细胞的吞噬活性，对巨噬细胞、自然杀伤性细胞有激活作用，能提高白细胞介素产生能力[8]，对体外培养的人肝癌HepG2、Bel-7402及喉癌Hep-2细胞的生长繁殖具有显著的抑制作用[9]，所以其子实体中多糖含量可以作为裂褶菌食药用价值高低的指标之一。王凤仙等[10]测定出裂褶菌子实体中含有15种氨基酸，赵琪等[11]综述裂褶菌能产生多种酶，所以对其蛋白质含量测定也可以衡量其食药用价值的高低。本研究建立了裂褶菌子实体中多糖和蛋白含量的测定方法，具有一定的理论和实际意义。

1 仪器与材料

紫外-可见分光光度计（UV2450日本岛津），葡萄糖对照品、牛血清蛋白对照品（购于北京索莱宝科技有限公司），裂褶菌子实体（采于长春中医药大学校园）。

2 方法与结果

2.1 子实体多糖含量的测定[12]

采用3，5—二硝基水杨酸定糖法测定裂褶菌子实体中多糖的含量。

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品25mg，置25mL容量瓶中加水定容至刻度，即得1mg/mL葡萄糖的标准品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 （1）供试品溶液的制备：精密称取子实体粉末2.5081g，加热回流提取3次，每次30min，合并滤液并浓缩，定容至50mL量瓶中，即得。作为总糖供试品和还原糖供试品备用。（2）总糖供试液的制备：精密量取供试品溶液2mL，置25mL容量瓶中，加6N盐酸8mL，置沸水浴加热30min，冷却，加1滴酚酞指示剂，用40%氢氧化钠溶液中和至微红色，加水定容至刻度，即得总糖供试液。（3）还原糖供试液制备：即为上述供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 线性关系考察 精密量取葡萄糖标品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL分别置于25mL容量瓶中，均加蒸馏水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂溶液，水浴5min，定容至刻度，摇匀。479nm波长下测定样品吸光值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，葡萄糖在0.0120～0.0400mg/mL范内呈良好的线性关系。

2.1.3.2 精密度试验 取葡萄糖对照品溶液0.7mL，置于25mL量瓶中，加蒸馏水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂溶液，水浴5min，定容至刻度，摇匀。479nm波长下连续测定6次吸光度值，RSD值为0.5981%。表明仪器精密度良好。

2.1.3.3 稳定性试验 取供试品溶液1mL，置于25mL量瓶中，加水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂溶液，水浴5min，定容至刻度，摇匀。置于479nm波长下，分别于0、0.5、1.0、1.5、2h 测定吸光度。其RSD值为0.7197%，表明供试品溶液在2h内稳定。

2.1.3.4 重复性试验 取同一子实体样品5份，分别按照2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别取1mL，置于25mL量瓶中，加蒸馏水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂溶液，水浴5min，定容，摇匀。置于479nm波长下测定吸光度值。其RSD值为1.0752%，表明本方法重复性良好。

2.1.3.5 加样回收率试验 称取已知总糖含量的子实体粉末6份，每份约1.25 g，精密称取，分别精密加入一定量的葡萄糖标准品，按照“2.1.2”项下制备方法制得续滤液，依法分别测总糖含量，计算加样回收率。实验数据见表1。结果表明，本方法葡萄糖加样回收率RSD为0.41%，说明该方法测定裂褶菌子实体糖的含量稳定可靠。

2.1.4 样品含量测定 按3，5-二硝基水杨酸定糖法对样品中总糖和还原糖进行测定，总糖减去还原糖即为多糖含量。计算出裂褶菌子实体中多糖的含量为7.26%。见表2。

2.2 蛋白质的含量测定[13-15]endprint

采用考马斯亮蓝法测定裂褶菌子实体中蛋白质的含量。

2.2.1 标准蛋白质溶液的配制 精密称定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，即得2mg/mL标准蛋白质溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取子实体粉末5.0082g，加8倍量生理盐水浸渍24h，滤液透析浓缩，定容至10mL量瓶中，即得供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 线性关系考察 精密加入标准蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于试管中，分别加生理盐水至0.2mL，再加入考马斯亮蓝试剂10mL，混匀，5min后于595nm波长下测定其吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白质在0.0078～0.0312mg/mL 范内呈良好的线性关系。

2.2.3.2 精密度试验 取供试品溶液，按照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度，重复6次，其RSD值为0.5142%，表明仪器精密度良好。

2.2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液，按照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，按照测定法每间隔5min测定其在595nm波长下吸光度，测定20min内吸光度值的变化，其RSD值为0.5920%，表明样品溶液在20min内稳定。

2.2.3.4 重复性试验 取子实体粉末6份，按照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度值，其RSD值为1.0867%，表明该方法测定蛋白质含量重复性良好。

2.2.3.5 加样回收率试验 取已知蛋白质含量的子实体粉末6份，每份约2.5g，精密称定，分别精密加入一定量的蛋白标准品，按供试品溶液制备方法得续滤液，依法测定吸光度，计算回收率，实验数据见表3。

2.2.3.6 样品含量测定 对供试品溶液进行测定，按照2.2.2项下操作，平行3份，测定其吸光度值。代入标准曲线计算样品蛋白质含量，子实体中总蛋白含量为0.26%，结果见表4。

3 讨论

裂褶菌子实体中多糖浓度在0.0120～0.040mg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子实体多糖含量为7.26%；蛋白浓度在0.0078～0.0321mg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子实体总蛋白含量为0.26%；本研究建立的方法简便、快速、准确，重复性好，为裂褶菌子实体多糖和蛋白质含量的测定提供了依据。多糖有提高免疫力等多种良好的药理作用，所以具有良好的研究与开发前景，本实验为开发新型药物提供了理论依据。

[参考文献]

[1] 卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州：河南科技技术出版社，2000：79.

[2] 陈慧芳.植物活性成分辞典（第一册）[M].北京：中国医药科技出版社，2000.

[3] 胡德群，胡鸣.裂褶菌多糖的研究[J].四川中草药研究，1994（36）：21-23.

[4] 朱泉娣.裂褶菌子实体无机元素分析[J].中草药，1986，17（8）：17-18.

[5] 李梦杰，王翠玲，张玉金，等.裂褶菌液体和固体培养产漆酶的比较研究[J].西南农业学报，2011，24（6）：2311-2315.

[6] 郭孟璧，田茂军，李聪，等.裂褶菌挥发油化学成分的研究[J].云南化工，2006，33（3）：16-27.

[7] 毛绍春，李竹英，李聪.裂褶菌化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2007，19（4）：610-613.

[8] 李兆兰.裂褶菌多糖的结构研究[J].南京大学学报（自然科学版），1994，30（3）：482-487.

[9] 宋爱荣，王光远，赵晨，等.裂褶菌多糖体外抑瘤试验[R].全国药用真菌学术研讨会论文集，2008：224.

[10] 王凤仙，夏志俊，江月仙，等.不同来源的裂褶菌子实体及发酵培养的菌丝体中氨基酸与无机元素分析[J].现代应用药学，1989，6（1）：18-20.

[11] 赵琪，袁理春，李荣春.裂褶菌研究进展[J].食用菌学报，2004，11（1）：59-63.

[12] 王丽娜，陈水钫，张兵，等. 3，5一二硝基水杨酸法测定多糖含量的研究进展[J].吉林医药学院学报，2009， 30（4）：232-234.

[13] 李娟，张推庭，曾伟，等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].中国生物制品学杂志，2000，13（2）：118-120.

[14] 徐杰伟，温少磊，蔡早育.考马斯亮蓝法测定微量蛋白的条件探讨[J].江西医学检验，2003，21（5）：353-354.

[15] 宋景秋，王以立.双缩脲法与考马斯亮蓝法测定母乳总蛋白的应用比较[J].临床检验杂志，1997，15（2）：108.

（收稿日期：2014-09-11）endprint

采用考马斯亮蓝法测定裂褶菌子实体中蛋白质的含量。

2.2.1 标准蛋白质溶液的配制 精密称定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，即得2mg/mL标准蛋白质溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取子实体粉末5.0082g，加8倍量生理盐水浸渍24h，滤液透析浓缩，定容至10mL量瓶中，即得供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 线性关系考察 精密加入标准蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于试管中，分别加生理盐水至0.2mL，再加入考马斯亮蓝试剂10mL，混匀，5min后于595nm波长下测定其吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白质在0.0078～0.0312mg/mL 范内呈良好的线性关系。

2.2.3.2 精密度试验 取供试品溶液，按照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度，重复6次，其RSD值为0.5142%，表明仪器精密度良好。

2.2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液，按照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，按照测定法每间隔5min测定其在595nm波长下吸光度，测定20min内吸光度值的变化，其RSD值为0.5920%，表明样品溶液在20min内稳定。

2.2.3.4 重复性试验 取子实体粉末6份，按照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度值，其RSD值为1.0867%，表明该方法测定蛋白质含量重复性良好。

2.2.3.5 加样回收率试验 取已知蛋白质含量的子实体粉末6份，每份约2.5g，精密称定，分别精密加入一定量的蛋白标准品，按供试品溶液制备方法得续滤液，依法测定吸光度，计算回收率，实验数据见表3。

2.2.3.6 样品含量测定 对供试品溶液进行测定，按照2.2.2项下操作，平行3份，测定其吸光度值。代入标准曲线计算样品蛋白质含量，子实体中总蛋白含量为0.26%，结果见表4。

3 讨论

裂褶菌子实体中多糖浓度在0.0120～0.040mg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子实体多糖含量为7.26%；蛋白浓度在0.0078～0.0321mg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子实体总蛋白含量为0.26%；本研究建立的方法简便、快速、准确，重复性好，为裂褶菌子实体多糖和蛋白质含量的测定提供了依据。多糖有提高免疫力等多种良好的药理作用，所以具有良好的研究与开发前景，本实验为开发新型药物提供了理论依据。

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[4] 朱泉娣.裂褶菌子实体无机元素分析[J].中草药，1986，17（8）：17-18.

[5] 李梦杰，王翠玲，张玉金，等.裂褶菌液体和固体培养产漆酶的比较研究[J].西南农业学报，2011，24（6）：2311-2315.

[6] 郭孟璧，田茂军，李聪，等.裂褶菌挥发油化学成分的研究[J].云南化工，2006，33（3）：16-27.

[7] 毛绍春，李竹英，李聪.裂褶菌化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2007，19（4）：610-613.

[8] 李兆兰.裂褶菌多糖的结构研究[J].南京大学学报（自然科学版），1994，30（3）：482-487.

[9] 宋爱荣，王光远，赵晨，等.裂褶菌多糖体外抑瘤试验[R].全国药用真菌学术研讨会论文集，2008：224.

[10] 王凤仙，夏志俊，江月仙，等.不同来源的裂褶菌子实体及发酵培养的菌丝体中氨基酸与无机元素分析[J].现代应用药学，1989，6（1）：18-20.

[11] 赵琪，袁理春，李荣春.裂褶菌研究进展[J].食用菌学报，2004，11（1）：59-63.

[12] 王丽娜，陈水钫，张兵，等. 3，5一二硝基水杨酸法测定多糖含量的研究进展[J].吉林医药学院学报，2009， 30（4）：232-234.

[13] 李娟，张推庭，曾伟，等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].中国生物制品学杂志，2000，13（2）：118-120.

[14] 徐杰伟，温少磊，蔡早育.考马斯亮蓝法测定微量蛋白的条件探讨[J].江西医学检验，2003，21（5）：353-354.

[15] 宋景秋，王以立.双缩脲法与考马斯亮蓝法测定母乳总蛋白的应用比较[J].临床检验杂志，1997，15（2）：108.

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采用考马斯亮蓝法测定裂褶菌子实体中蛋白质的含量。

2.2.1 标准蛋白质溶液的配制 精密称定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，即得2mg/mL标准蛋白质溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取子实体粉末5.0082g，加8倍量生理盐水浸渍24h，滤液透析浓缩，定容至10mL量瓶中，即得供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 线性关系考察 精密加入标准蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于试管中，分别加生理盐水至0.2mL，再加入考马斯亮蓝试剂10mL，混匀，5min后于595nm波长下测定其吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白质在0.0078～0.0312mg/mL 范内呈良好的线性关系。

2.2.3.2 精密度试验 取供试品溶液，按照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度，重复6次，其RSD值为0.5142%，表明仪器精密度良好。

2.2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液，按照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，按照测定法每间隔5min测定其在595nm波长下吸光度，测定20min内吸光度值的变化，其RSD值为0.5920%，表明样品溶液在20min内稳定。

2.2.3.4 重复性试验 取子实体粉末6份，按照2.2.2项下制备，移取0.2mL溶液，依法在595nm波长下测定其吸光度值，其RSD值为1.0867%，表明该方法测定蛋白质含量重复性良好。

2.2.3.5 加样回收率试验 取已知蛋白质含量的子实体粉末6份，每份约2.5g，精密称定，分别精密加入一定量的蛋白标准品，按供试品溶液制备方法得续滤液，依法测定吸光度，计算回收率，实验数据见表3。

2.2.3.6 样品含量测定 对供试品溶液进行测定，按照2.2.2项下操作，平行3份，测定其吸光度值。代入标准曲线计算样品蛋白质含量，子实体中总蛋白含量为0.26%，结果见表4。

3 讨论

裂褶菌子实体中多糖浓度在0.0120～0.040mg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子实体多糖含量为7.26%；蛋白浓度在0.0078～0.0321mg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子实体总蛋白含量为0.26%；本研究建立的方法简便、快速、准确，重复性好，为裂褶菌子实体多糖和蛋白质含量的测定提供了依据。多糖有提高免疫力等多种良好的药理作用，所以具有良好的研究与开发前景，本实验为开发新型药物提供了理论依据。

[参考文献]

[1] 卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州：河南科技技术出版社，2000：79.

[2] 陈慧芳.植物活性成分辞典（第一册）[M].北京：中国医药科技出版社，2000.

[3] 胡德群，胡鸣.裂褶菌多糖的研究[J].四川中草药研究，1994（36）：21-23.

[4] 朱泉娣.裂褶菌子实体无机元素分析[J].中草药，1986，17（8）：17-18.

[5] 李梦杰，王翠玲，张玉金，等.裂褶菌液体和固体培养产漆酶的比较研究[J].西南农业学报，2011，24（6）：2311-2315.

[6] 郭孟璧，田茂军，李聪，等.裂褶菌挥发油化学成分的研究[J].云南化工，2006，33（3）：16-27.

[7] 毛绍春，李竹英，李聪.裂褶菌化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2007，19（4）：610-613.

[8] 李兆兰.裂褶菌多糖的结构研究[J].南京大学学报（自然科学版），1994，30（3）：482-487.

[9] 宋爱荣，王光远，赵晨，等.裂褶菌多糖体外抑瘤试验[R].全国药用真菌学术研讨会论文集，2008：224.

[10] 王凤仙，夏志俊，江月仙，等.不同来源的裂褶菌子实体及发酵培养的菌丝体中氨基酸与无机元素分析[J].现代应用药学，1989，6（1）：18-20.

[11] 赵琪，袁理春，李荣春.裂褶菌研究进展[J].食用菌学报，2004，11（1）：59-63.

[12] 王丽娜，陈水钫，张兵，等. 3，5一二硝基水杨酸法测定多糖含量的研究进展[J].吉林医药学院学报，2009， 30（4）：232-234.

[13] 李娟，张推庭，曾伟，等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].中国生物制品学杂志，2000，13（2）：118-120.

[14] 徐杰伟，温少磊，蔡早育.考马斯亮蓝法测定微量蛋白的条件探讨[J].江西医学检验，2003，21（5）：353-354.

[15] 宋景秋，王以立.双缩脲法与考马斯亮蓝法测定母乳总蛋白的应用比较[J].临床检验杂志，1997，15（2）：108.

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