高效液相色谱法同时测定凤仙花中槲皮素和山奈酚含量

魏红立 刘俊霞 侯文欣 吕勤芝

凤仙花(impatiers balsomina)为凤仙花科植物风仙的花，该植物全草、根、种子均可入药，具有祛风除湿、活血、消肿、止痛之功效，用于治疗跌打损伤，腰腹疼痛，痈疽，疗疮，鹅掌风，灰指甲等症［1，2］。文献报道，凤仙花的有效成分为黄酮类和奈醌衍生物［3，4］，其中槲皮素能溶于冷乙醇(1∶290)，易溶于热乙醇(1∶23)，可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等，几乎不溶于水，山奈酚微溶于水，溶于热乙醇，乙醚和碱。槲皮素是一种重要的黄酮类化合物，槲皮素具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用，用于治疗慢性支气管炎。文献报道有方法同时测定芦丁、槲皮素和山奈酚的含量［5］，经我们实验验证，重现性差。经查阅资料凤仙花中芦丁经酸水解后生成槲皮素，我们怀疑重现性差的原因可能与芦丁未水解完全有关，另外，该方法提取耗时长。因此，我们对该方法进行改进。为更好的开发利用该药材资源提供理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 高效液相色谱仪(Waters e2695)二极管阵列检测器、Shimadzu 2010A高效液相色谱仪(LC-2010A HT低压四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器)LC-Solution工作站软件色谱柱:SHIMADZU(Shim-pack VP-ODS Column Size 250 mm ×4.6 mm 5 μm Serial No.4062928);Sartorius万分之一和 Sartorius十万分之一电子天平;KQ-600D型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。8批凤仙花样品产地分别为河北安国、云南、安徽、河南、内蒙、湖北、山东。

1.2 溶液制备

1.2.1 对照品溶液的制备:分别精密称取槲皮素和山奈酚对照品适量，用甲醇稀释，制成浓度分别为0.02 mg/ml和0.1 mg/ml的混合溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备:精密称取本品粉末0.5 g，加入25%盐酸4 ml，再加入甲醇16 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，功率420 W，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量。过滤，滤液中加入20 ml水，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(150 mm × 4.6 mm，5 μm)。流动相:甲醇-0.4% 磷酸溶液(50∶50);检测波长:360 nm;流速:0.7 ml/min;柱温 30℃。

2.2 专属性 取混合对照品溶液、供试品溶液，按上述色谱条件测定，并采用二极管阵列检测器对峰纯度进行测试，表明其他成分不干扰被测成分的测定。见图1～4。

图1 混合对照品

图2 样品HPLC色谱图

2.3 线性关系考察

图3 对照品峰纯度图

图4 样品峰纯度图

2.3.1 精密称取槲皮素对照品(批号:100081-200907含量以 96.5%计)10.36 mg，置 10 ml量瓶中，作为储备液。再分别精密吸取 1 ml置100 ml、50 ml、25 ml、10 ml、5 ml、2 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得一系列浓度的溶液。精密吸取上述6种溶液各10 μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，以浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为:Y=5.608 ×107X+8.018 ×104，R2=0.9999。表明槲皮素在 0.1000 μg ～ 4.9987 μg 范围内线性关系良好。

2.3.2 精密称取山奈酚对照品(批号:110861-201209含量以93.2%计)10.49 mg，置10 ml量瓶中，作为贮备液。再分别精密吸取 1 ml置 100 ml、50 ml、25 ml、10 ml、5 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得一系列浓度的溶液。精密吸取上述5种溶液和贮备液各10 μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，以浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为:Y=5.7267 ×107x+3.8767 ×104，R2=0.9998。表明山奈酚在0.098 ～9.777 μg 范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验 精密称取槲皮素对照品(批号:100081-200907含量以 96.5%计)10.69 mg置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。再精密量取2 ml置100 ml的量瓶中。精密称取山奈酚对照品(批号:100861-201209含量以 95.9%计)10.86 mg置上述100 ml的量瓶中，用甲醇溶解并稀释制成二者的混合溶液。精密吸取上述混合溶液10 μl，连续进样6次，槲皮素色谱峰面积的RSD值为0.26%，山奈酚峰面积的RSD为0.28%。表明用该方法测定槲皮素和山奈酚精密度良好。

2.5 稳定性试验 仪器自动精密吸取供试品溶液(4号)10 μl，注入高效液相色谱仪，分别在 0、2、4、8、12、24 h进样，计算峰面积的RSD，结果槲皮素色谱峰面积的RSD为0.62%，山奈酚色谱峰面积的 RSD为0.24%。表明样品溶液在24 h内稳定。

2.6 重复性试验 称取凤仙花药材粉末(1号)6份，每份 0.5 g，精密称定，(1)0.4919 g，(2)0.5064 g，(3)0.5061 g，(4)0.5032 g，(5)0.5055 g，(6)0.5030 g，按照含量测定方法进行处理，结果槲皮素含量RSD为0.63%，山奈酚含量RSD为1.0%。表明本方法重复性良好，适用于凤仙花中槲皮素和山奈酚的提取及含量的测定。

2.7 加样回收试验 称取凤仙花药材(1号)6份，每份 0.5 g，精密称定，(1)0.4995 g，(2)0.4970 g，(3)0.4980 g，(4)0.5010 g，(5)0.4910 g，(6)0.4912 g，分别置锥形瓶中。精密称取槲皮素对照品(批号:100081-200907，含量以 96.5% 计)10.40 mg 置 10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，再精密量取1 ml置25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度。作为标加溶液，分别精密吸取4 ml此溶液置上述6个锥形瓶中。精密称取山奈酚对照品(批号:110861-201209，含量以93.2%计)23.52 mg置25 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为标加溶液，分别精密量取2 ml置上述6个锥形瓶中。将加标样后的6份样品按照含量测定方法进行处理，计算回收率，槲皮素为102.27%，RSD为0.66%;山奈酚为 104.16%，RSD 为 0.83%。

2.8 耐用性试验 分别采用ShimadzuLC-2010A液相色谱仪和 Welch Materials(4.6 mm ×250 mm，5 μm)色谱柱、Waters e2695液相色谱仪和ODS-2HYPERSIL(250 mm，5 μm)色谱柱测定同批样品。见表1。

表1 耐用性试验结果 %

2.9 含量测定结果 共收集8批样品，8批样品按拟定的含量测定方法进行测定。见表2。

表2 含量测定结果

3 讨论

供试品提取我们选择了加入4 ml、8 ml盐酸两种方案，结果加入4 ml、8 ml盐酸后含量测定结果没有明显区别，因此我们选择加入4 ml盐酸水解。加酸后放置1 h、2 h时间对测定结果没有明显影响。因此，加酸后不放置。经验证用乙酸乙酯萃取3次，每次20 ml，可将待测成分完全萃取出来。

与文献［6，7］方法比较该方法耗时短，操作简便，重现性较好，能够为凤仙花的开发利用提供理论依据。

1 怡悦.凤仙花的抗过敏作用机制的研究.国外医学(中医中药分册)，1998，20:57.

2 于丽云.凤仙花属植物提取物治疗皮肤感染、炎症和过敏反应.国外医药(植物药分册)，1994，9:134.

3 危建安，谢琪.凤仙花研究进展.时珍国医国药，2001，12:164-165.

4 胡喜兰，朱慧，刘存瑞，等.凤仙花的化学成份研究.中成药，2003，25:833-834.

5 郝治湘，刘玉芬，周丽华.反相高效液相色谱法测定凤仙花中芦丁、槲皮素和山奈酚的含量.化工时刊，2006，20:42-43、49.

6 高灵玲.杨小平凤仙花药材性状与粉末显微特征鉴别.中药材，1988，21:290.

7 王晓飞，于玲，杜华霜，等.三白草中槲皮素的薄层色谱鉴别.中国民族民间医药，2010，23:61.