高效液相色谱法测定氯普噻吨片中E-异构体含量

孙 桐，庄 航，葛雪松，张新勇

(江苏省宿迁市食品药品检验所，江苏 宿迁 223800)

氯普噻吨片用于治疗急、慢性精神分裂症，适用于伴有精神运动性激越、焦虑、抑郁症状的精神障碍。氯普噻吨为硫杂蒽类抗精神病药，可通过阻断脑内神经突触后多巴胺受体而改善精神障碍，也可抑制脑干网状结构上行激活系统，起到镇静作用，还可抑制延脑化学感受区而发挥止吐作用，并有抗抑郁及抗焦虑作用。氯普噻吨分子结构中存在双键，有顺式和反式2 种异构体，顺式(氯普噻吨)的抗精神病作用为反式(E-异构体)的8 倍，这可能是顺式异构体能与多巴胺分子部分重叠所致[1]。该药现行标准《中华人民共和国药典·2010 年版第一增补本》氯普噻吨片有关物质检查项下，并未限定E-异构体的含量，难以控制该药品的质量。为确保疗效，参考文献[2 -4]，本研究采用高效液相色谱法对本品进行氯普噻吨E-异构体的含量检查。

1 仪器与试药

Waters 2695/2487 型高效液相色谱仪;XP205 Mettler Toledo 电子天平。氯普噻吨对照品(European Pharmacopoeia Reference Standard)，含2.0%E-异构体;氯普噻吨片(上海信谊药厂有限公司，批号分别为130101，130217，130517，规格为每片含25 mg);磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠、甲醇均为色谱纯，四丁基溴化铵为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流速:1.5 mL/min;柱温:30 ℃;流动相:以磷酸盐缓冲溶液(取磷酸二氢钾6.0 g、十二烷基硫酸钠2.9 g、四丁基溴化铵9 g，加水550 mL溶解)-甲醇-乙腈(55 ∶5 ∶40)[1-2];流速:1 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:254 nm。

2.2 溶液制备

避光操作，取氯普噻吨对照品100.06 mg，置100 mL 容量瓶中，加乙腈20 mL 溶解，加流动相稀释至刻度，作为对照品贮备溶液;精密量取1，2，3，5，10 mL，分别置20 mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。避光操作，取本品20 片，研细，称取相当于含50 mg 的氯普噻吨的细粉，置50 mL 容量瓶中，加乙腈10 mL 溶解，加流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

干扰试验:按处方取相同辅料混合，制成不含氯普噻吨的阴性对照品溶液。取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各20 μL 注入液相色谱仪测定，色谱图见图1 。结果表明，辅料对E-异构体测定无干扰。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:取对照品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品溶液质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=37 919 X-178，r=0.999 8。结果表明，氯普噻吨E-异构体质量浓度在1.001 ～10.015 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密量取对照品溶液20 μL，连续进样6 次，测定峰面积。结果E-异构体峰面积的RSD=0.9%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密量取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，20 h 时进样20 μL 测定。结果E-异构体峰面积的RSD=1.2%(n=6)，表明供试品溶液在20 h 内稳定。

加样回收试验:精密量取同一批样品9 份，每份加入适量的E-异构体，按2.2 项下方法制备供试品溶液，进样20 μL 测定，计算回收率。结果见表1。

表1 E-异构体加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定

取含E-异构体对照品溶液与2.2 项下制备的供试品溶液，进样20 μL，按外标法计算样品含量。结果批号分别为130101，130217，130517 的样品中E-异构体含量分别为0.18%，0.27%，0.31%。

3 讨论

由于氯普噻吨的E-异构体国内无对照品供应，进口对照品价格昂贵，自行配制合成难度大，故选择相对便宜的进口氯普噻吨对照品(European Pharmacopoeia Reference Standard，含2.0%E-异构体)，其中含有的E-异构体已做定量，通过换算，完全可以替代E-异构体对照品进行定量定性检测。

现行欧洲药典(EP7.5)和美国药典(USP32)均收录氯普噻吨片，采用主成分自身对照法对E-异构体的含量进行计算，规定其含量不得超过0.3%。而现行标准2010 年版《中国药典·第一增补本》氯普噻吨片有关物质检查项下，没有引入对照品进行系统适用性试验，只规定主峰和相邻杂质峰分开。引入氯普噻吨E-异构体对照品，可使检验人员正确执行有关物质检查项检验。试验证明，氯普噻吨E-异构体与氯普噻吨分离度大于7.5，可使各杂质组分有效分开。

本研究中参考欧洲药典，试验时考察了甲醇-磷酸盐缓冲液、甲醇-水、乙腈-磷酸盐缓冲液、甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液等流动相体系，结果发现，流动相体系中加入磷酸盐缓冲溶液可有效预防色谱峰拖尾，甲醇-磷酸盐缓冲液体系对杂质的分离效果差，而在乙腈-磷酸盐缓冲液体系中加入适量甲醇，E-异构体的峰形更佳。故最终选择甲醇-乙腈-磷酸盐缓冲液体系作为流动相。为了满足主成分与E-异构体的分离效果，主要通过调节流动相中乙腈含量的方法来解决。乙腈量超过15%时，消除了溶剂峰对主成分峰的影响，而乙腈量到50%时，主成分峰与E-异构体峰不能有效分离。综合考虑，选择磷酸盐缓冲溶液(取磷酸二氢钾6.0 g、十二烷基硫酸钠2.9 g、四丁基溴化铵9 g，加水550 mL 溶解)-甲醇-乙腈(55 ∶5 ∶40)为流动相。

[1] 潘振民. 立体异构药物的药理效应[J]. 中国药业，1997，6(4):16-17.

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典·2010 年版第一增补本[M].北京:中国医药科技出版社，2010:496.

[3] 陈建琴. 反相高效液相色谱法测定氯普噻吨片的含量[J]. 中国现代应用药学，2007，24(3):222 -223.

[4] 陈素来. 对中国药典氯普噻吨片含量测定中氯仿提取法的改进建议[J]. 药物分析杂志，1998，18(2):118 -119.