毛细管气相色谱法测定注射用利培酮微球中有机溶剂残留量

马建芳，朱瀛华，任飞亮，刘 蔚，彭兴盛，陈桂良

(上海市食品药品检验所，上海 200131)

注射用利培酮微球(商品名恒德® )是由美国杨森公司研发生产的首个长效非典型性抗精神病药物，结合了长效剂型和非典型抗精神病药的优势，可显著改善精神分裂症引起的阳性症状和阴性症状[1-2]，具有用药次数少、可持续释放药物、血药浓度平稳、不良反应发生率低、有效性和安全性高、患者依从性和耐受性好的优点[3]，被广泛应用于临床。利培酮微球制备过程中使用的有机溶剂包括乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇，在微球固化成型过程中，致密坚硬的高分子材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物可阻碍有机溶剂的挥发，造成有机溶剂残留[4-5]。残留的有机溶剂会引起患者注射部位刺激或疼痛，影响药物在体内的释放，从而影响药效，因此应控制利培酮微球中的残留溶剂，以提高产品质量，保证用药安全。2010 年版《中国药典(二部)》中规定，乙醇和乙酸乙酯是第3 类溶剂，限度为0.5%，未对苯甲醇的限度作要求。本研究中建立了可同时测定注射用利培酮微球中的残留溶剂乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇含量的毛细管气相色谱法，具有操作简单、灵敏度高、重复性好、专属性强、快速准确的特点，可作为利培酮微球中有机溶剂残留量检测的质量控制方法。

1 仪器与试药

6890A 型气相色谱仪(美国Agilent 公司)。注射用利培酮微球(美国杨森公司，批号为DJZSW00，DKZSG00，DKZSS00);乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇、苯乙醇和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱:DB-624 型毛细管柱(94 %二甲基聚硅氧烷和6 %氰丙基苯聚硅氧烷，320 μm×30 m，1.8 μm);氢火焰离子化检测器(FID):检测器温度为250 ℃，进样口温度为220 ℃，氦气为载气，采用恒流模式，流速为1.0 mL/min，氢气流速为35 mL/min，空气流速为350 mL /min，尾吹气流速为25 mL /min;进样量:3 μL;分流比:10 ∶1;分析方法:程序升温，初始柱温130 ℃，平衡5 min，以70 ℃/min 的速度升温至240 ℃，平衡10 min。取对照品溶液依法进样测定，乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇和苯乙醇的理论板数均大于5 000，各有机溶剂色谱峰完全分离，分离度均大于2.5，色谱图见图1。

2.2 溶液制备

取DMF 适量，置1 000 mL 容量瓶中，加乙酸丙酯25 μL 和苯乙醇150 μL，用DMF 稀释至刻度，摇匀，作为内标溶液，其中乙醇和乙酸乙酯以乙酸丙酯为内标，苯甲醇以苯乙醇为内标。取内标溶液适量，置100 mL 容量瓶中，精密称取乙醇155.49 mg、乙酸乙酯50.49 mg 和苯甲醇177.54 mg，置100 mL 容量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液5 mL，置50 mL 容量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，制成乙醇155.49 μg/mL、乙酸乙酯50.49 μg/mL 和苯甲醇177.54 μg/mL的溶液，作为对照品溶液。精密称取样品内容物100 mg，置10 mL容量瓶中，加内标溶液约7 mL，超声10 ～15 min，使微球溶解，放冷至室温，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验:取上述5 种溶剂适量，分别置10 mL 容量瓶中，加入DMF 稀释至刻度，摇匀，作为5 种溶剂的定位溶液。将上述定位溶液分别注入气相色谱仪，按拟订色谱条件依法进样测定，结果出峰顺序依次为乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇和苯乙醇，定位溶液中各组分的保留时间与对照品溶液中各组分保留时间一致，表明专属性较强。

线性关系考察:分别精密量取对照品贮备液0.25，0.50，1.00，2.00，2.50，5.00，6.00，7.50 mL，各置50 mL 容量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，即得系列质量浓度对照品溶液。按拟订色谱条件依法进样测定，记录色谱图，以各个残留溶剂的质量浓度(C)为横坐标、对应主峰面积与内标物峰面积的比值(Y)为纵坐标(乙醇和乙酸乙酯以乙酸丙酯为内标，苯甲醇以苯乙醇为内标)进行线性回归，得到回归方程和相关系数，详见表1。

精密度试验:取2.2 项下对照品溶液，重复进样6 次。计算得乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇峰面积与对应内标物峰面积比值的RSD分别为2.63%，1.91%，0.94% ( n=6)，表明仪器精密度良好。

加样回收试验:分别精密量取对照品贮备液2.50，5.00，7.50 mL，各置已精密称取注射用利培酮微球内容物500 mg 的50 mL 容量瓶中，各3 份，加内标溶液约35 mL，超声10 ～15 min，使微球溶解，放冷至室温，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为低、中、高浓度供试品溶液。另精密称取本品500 mg，置50 mL 容量瓶中，加内标溶液约35 mL，超声10 ～15 min，使微球溶解，放冷至室温，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为空白对照溶液。按拟订色谱条件依法进样测定，计算回收率。结果见表2。

图1 气相色谱图

表1 线性关系考察结果及回归方程(μg/mL)

稳定性试验:按2.2 项下方法制备供试品溶液，取同一供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，2，6，12，24，36，48 h 时依法进样测定。结果乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇峰面积与对应内标物峰面积比值的RSD 分别为3.43%，1.52%，1.02%(n=7)，表明供试品溶液在48 h 内稳定。

表2 乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定

按2.2 项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，按拟订色谱条件分别依法进样测定，以内标法计算各有机溶剂残留量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果(%)

3 讨论

进样方式和溶剂选择:微球的固化成型可能会影响制备过程中所用有机溶剂的挥发，残留的有机溶剂可影响药物稳定性，且增加毒副作用，故残留的有机溶剂量不应超过2010 年版《中国药典(二部)》的限量规定[6]。残留溶剂测定方法中，常用的进样方式主要有顶空进样和直接进样。本试验的预试验结果表明，采取直接进样法时，乙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、苯甲醇和苯乙醇的分离度较好，各组分间不相互干扰，灵敏度高，相较顶空进样，可避免顶空没有完全平衡和顶空进样等带来的测定误差，且顶空进样装置容易引起乙醇和苯甲醇的残留，故本方法采用溶液直接进样。直接进样时，样品应完全溶解于溶剂中，经试验，利培酮微球中的主要辅料高分子材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物可完全溶解于DMF 中，DMF 的沸点较高，很少干扰其他残留溶剂的检查。结果表明，采用直接进样法，利培酮微球中的辅料及溶剂DMF 对被测溶剂及内标物均无干扰，各组分峰之间的分离度均大于2.5。

色谱柱选择:预试验中比较了不同极性的毛细管色谱柱的分离效果，由于5 个溶剂的极性有较大区别，HP-1 和HP-5 等非极性色谱柱和DB-WAX 等极性色谱柱的分离效果均不理想，而中等极性色谱柱DB-624 对各溶剂峰的分离效果最优，且待测组分灵敏度高。在极性差异的基础上，考虑到各个溶剂的沸点差异，为实现各色谱峰的有效分离并尽量缩短分析时间，采用了程序升温的方法。比较了不同的起始柱温(120，130，140，150，160，170，180 ℃)和不同的升温速率(40，50，60，70，80 ℃/min)条件下各溶剂峰的分离效果。结果，130 ℃保持5 min 可使低沸点的乙醇、乙酸乙酯和乙酸丙酯尽早出峰并有效分离，然后以70 ℃/min的速度升温至240 ℃保持10 min 的程序升温条件，可显著缩短高沸点溶剂苯甲醇和苯乙醇的出峰时间，基线漂移范围小，可显著改善峰形，各溶剂峰均得到有效分离，避免微球辅料在毛细管柱中残留的现象出现。

定量方式选择:内标法可避免样品处理或进样体积误差对结果的影响，在测定挥发性残留溶剂时定量较准确。内标物应不干扰被测物的出峰，响应较好，为保证内标物的定量准确，内标物的保留时间应尽可能与被分析物质接近。苯甲醇的沸点显著高于乙醇和乙酸乙酯，为保证定量准确，分别采用乙酸丙酯和苯乙醇作为乙醇、乙酸乙酯和苯甲醇的内标，定量准确。结果表明，各残留溶剂的线性关系良好，精密度和准确度高，回收率符合要求。

[1] Park EJ，Amatya S，Kim MS，et al.Long-acting injectable formulations of antipsychotic drugs for the treatment of schizophrenia[J] .Arch Pharm Res，2013，36(6):651 -659.

[2] Nielsen J，Jensen SO，Friis RB，et al. Comparative effectiveness of risperidone long-acting injectable vs first-generation antipsychotic long-acting injectables in schizophrenia:results from a nationwide，retrospective inception cohort study[J].Schizophr Bull，2015，41(3):627 -636.

[3] 王丽莉. 第一个长效非典型抗精神病药—— 注射用利培酮微球[J].中国新药杂志，2010，19(22):2 066 -2 068.

[4] 左志辉，王 卫. 利培酮中有机溶剂残留的顶空毛细管气相色谱法测定[J]. 中国医药工业杂志，2013，44(5):496 -498.

[5] 张 华，王 翔，王学清，等. 注射用利培酮微球的制备和体外性质评价[J]. 中国新药杂志，2013，22(20):2 423 -2 426.

[6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)[M]. 北京:中国医药科技出版社，2010:附录ⅧP 61 -65.