气相色谱法测定饲料中香芹酚和百里香酚的含量

2015-01-18董茂锋杨海锋饶钦雄赵志辉

饲料工业 2015年1期

■董茂锋杨海锋白冰韩薇饶钦雄赵志辉

（上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所上海市饲料监督检测站，上海 201403）

目前食用香料被广泛应用于社会各个方面，且种类繁多，欧盟允许使用的食用香料物质约2 800多种[1]，CAC的JECFA(食品添加剂联合专家委员会)已评价约1 800种[2]，美国GRAS24名单中允许使用的有约2 600种。在农业部《饲料添加剂品种目录（2008）》（中华人民共和国农业部公告第1126号）规定了作为食品用的香料允许在养殖动物中使用。香芹酚和百里香酚作为目前应用最为广泛的重要香料之一，被广泛应用于饲料添加。随着香芹酚和百里香酚的生产技术提高以及其在饲料工业中所具有的优势，作为饲料调味剂香芹酚和百里香酚在饲料生产中的应用日益广泛[3-4]。

目前国内外对于香芹酚和百里香酚的研究主要集中在对各种细菌、病毒以及螨类等微生物的抑制研究，而关于饲料以及饲料添加剂中的化学分析报道比较缺乏。杨希国等建立了简单的未净化的测定香芹酚和百里香酚的液相色谱方法[5]。但是采用气相色谱法的检测方法未见报道，本文采用了分散固相萃取的前处理净化方式测定饲料中香芹酚和百里香酚，分析方法简便可靠，且检出限远低于目前报道的50 mg/kg。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

TRACE 2000火焰离子化检测器的气相色谱仪(美国Thermo公司)；Agilent DB-17ms色谱柱（30.0 m×0.32 mm× 0.25 μm；美国Agilent公司）；Agilent HP-5ms色谱柱（30.0 m×0.32 mm× 0.25 μm；美国Agilent公司）；MS 2涡旋混匀器（德国IKA）；超声仪（KUDOS公司）；回旋震荡器（中国翔天）；R-210带水浴加热的旋转蒸发仪（美国BUSHI公司）；11-R高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)；吸附材料，氧化铝、C18、GCB(石墨化炭黑)、PSA（乙二胺-N-丙基硅烷）、二氧化硅（中国Agela公司）；甲醇、异丙醇、丙酮、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、乙腈和无水硫酸钠为分析纯（中国国药）；乙酸乙酯色谱纯；香芹酚和百里香酚标准品（纯度≥98%，购买于SIGMA），称取适量上述标准品用色谱纯乙酸乙酯配置成质量浓度为1 000 mg/l标准储备溶液。饲料样本均为上海本地生产饲料。

1.2 气相色谱条件

载气：N2；流速：2.0 ml/min；升温程序：70 ℃以25℃/min升至130℃，再以35℃/min升至250℃，保持3 min；进样口温度230℃；检测器温度300℃；空气流量：380 ml/min；：氢气流量：40 ml/min；进样量：1 μl。百里香酚和香芹酚保留时间分别是7.7、8.0 min(见图1)。

图1 香芹酚和百里香酚的气相色谱

1.3 样品的提取

称取约 8 g试样（精确至0.01 g），置入 50 ml离心管中，准确加入20 ml乙酸乙酯，超声提取90 min，4 000 r/min离心1 min，待净化。

1.4 样品的净化

取1.0 ml提取液于存有50 mg无水硫酸钠、50 mg PSA、50 mg GCB的2 ml离心管，涡旋混合30 s，经滤膜过滤，装进样小瓶，待测。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的确定

合适的提取溶剂决定了对香芹酚和百里香酚的提取效果，试验首先考察了8种常规有机溶剂的提取效果，通过在超声提取作用下，比较甲醇、异丙醇、丙酮、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醇和乙腈的提取效率。试验采用香芹酚和百里香酚的添加剂为饲料样本对象，观察超声提取30、60、90、120、150、180 min和210 min内，香芹酚和百里香酚的含量变化，结果见图2和图3。

图2和图3显示，正己烷和乙酸乙酯对百里香酚和香芹酚的提取效果最好，正己烷为提取溶剂时，香芹酚和百里香酚的最高含量分别是0.27%和0.252%，乙酸乙酯为提取溶剂时，分别是0.27%和0.257%。在提取时间方面，超声提取前90 min，香芹酚和百里香酚的含量随着提取时间增加而增加，在90～210 min超声提取阶段，香芹酚和百里香酚含量无明显变化。以上说明在超声提取下，正己烷和乙酸乙酯的提取效果高于其余7种有机溶剂，且90 min为超声提取的最佳时间。

图2 不同有机溶剂对香芹酚的提取效果

图3 不同有机溶剂对百里香酚的提取效果

2.2 超声提取和震荡提取的比较

在以上试验结果基础上，考察了正己烷和乙酸乙酯在超声提取和在3 min涡旋提取两种提取手段下对香芹酚和百里香酚的提取效果。试验以香芹酚和百里香酚饲料添加剂为试验对象，比较在两种提取方法和两种溶剂下，目标化合物的提取效果，结果见图4。

图4 超声提取和涡旋提取的比较

由图4可知，超声提取效果明显高于涡旋提取；采用超声提取时，正己烷与乙酸乙酯的提取效果无明显差异，使用正己烷超声提取时，香芹酚和百里香酚的含量分别为0.265%和0.248%，使用乙酸乙酯超声提取时，香芹酚和百里香酚的含量分别为0.257%和0.245%。综上所述，香芹酚和百里香酚的最佳的提取溶剂为乙酸乙酯和正己烷，超声提取90 min即可。

2.3 净化方式确立

2.3.1 吸附材料的影响

试验采用了改良后的QuEChERS方式作为去除杂质的净化手段，首先考察了提取溶剂为正己烷和乙酸乙酯时，氧化铝、C18、GCB(石墨化炭黑)、PSA（乙二胺-N-丙基硅烷）、二氧化硅五种常用吸附材料对香芹酚和百里香酚的吸附作用。吸附材料分别为50、100 mg和200 mg时，净化后香芹酚和百里香酚的回收率变化，比较净化吸附材料对目标化合物的影响。图5～图6是分别使用正己烷、乙酸乙酯为溶剂的香芹酚和百里香酚回收率。由图5可知，当溶剂为正己烷时，PSA和二氧化硅对百里香酚和香芹酚有明显的吸附作用，随着吸附材料的增加，香芹酚和百里香酚回收率有下降趋势，吸附材料量从50 mg增加到200 mg的过程中，香芹酚和百里香酚的平均回收率分别为5.35%～4.57%（PSA）、75.84%～61.32%(二氧化硅)和4.84%～3.98%（PSA）、79.03%～59.62%(二氧化硅)；随着GCB的增加，香芹酚和百里香酚的回收率下降明显，分别下降13.69%和9.82%；而氧化铝和C18对目标化合物的吸附较少，香芹酚和百里香酚的回收率在92.08%～93.73%之间，当吸附材料50 mg增加到200 mg时，其变化都低于10%。

图6是以乙酸乙酯为提取溶剂时，香芹酚和百里香酚的回收率随着吸附材料质量变化趋势图。随着吸附材料质量的增加，香芹酚和百里香酚的回收率都有不同程度的降低，但是五种吸附材料对两种香料的吸附较少，回收率在80.67%～109.39%之间，其中GCB对香芹酚和百里香酚的吸附较其它四种吸附材料大，分别降低23.49%和25.57%，其余四种吸附材料中，下降在10%以内。

图5 提取溶剂为正己烷时香芹酚和百里香酚的回收率

图6 提取溶剂为乙酸乙酯时香芹酚和百里香酚的回收率

综上所述，乙酸乙酯为溶剂时，吸附材料对香芹酚和百里香酚的吸附效率较小，明显优于正己烷为溶剂时吸附材料对香芹酚和百里香酚的吸附作用；但是GCB的量改变对香芹酚和百里香酚的影响较大，建议净化时适当降低GCB的用量。

2.3.2 吸附效果的影响

依据2.3.1节试验结果，选择8种不同饲料，考察以乙酸乙酯为溶剂时吸附材料的净化效果以及对香芹酚和百里香酚的吸附效果。试验结果显示，GCB对去除饲料中的色素类杂质具有明显效果。从色谱图的空白对照比较发现，除PSA对有些杂质有吸附外，其余四种吸附材料无明显效果。

综上所述，试验确定了以50 mg GCB、50 mg PSA和50 mg无水硫酸钠（除水作用）的净化方式；由于正己烷的弱极性在净化后容易引起香芹酚和百里香酚的损失，结合样品提取条件的结论，试验确定了20 ml乙酸乙酯为提取溶剂。

2.4 基质效果的选择

由于在采用带火焰离子化检测器的气相色谱检测过程中，纯溶剂的标准物质和样品的溶液条件不同而会引发基质效应的产生。试验考察了香芹酚和百里香酚的基质效应，通过在空白样本中加入香芹酚和百里香酚的标样，计算基质标样与溶剂标样的差值，评价香芹酚和百里香酚的基质效应。按照η=（Ai/As）基质标样/（Ai/As）溶剂标样公式计算。试验结果显示在十种饲料样本中香芹酚和百里香酚的基质效应平均η在0.935～0.981范围内，数值均接近1，说明基质效应不明显，对气相色谱仪测定结果不产生显著影响。

2.5 方法的准确度和精确度测定

选用10种常见的饲料样本，分别是鱼料配合料(A)、仔猪配合料(B)、猫料配合料(C)、仔鸡配合料(D)、乳猪浓缩料(E)、畜禽浓缩料(F)、仔猪浓缩料(G)、猪预混料(H)、鸡预混料(I)和鱼预混料(J)作为基质做添加回收试验。试验选择了三个添加水平（10、100、200 mg/kg），每个样本三个平行，结果见表1。试验结果显示10种饲料中香芹酚和百里香酚的添加回收率在77.97%～104.04%之间，RSD在0.63%～9.92%之间。

表1 10种饲料中香芹酚和百里香酚的添加回收率和相对标准偏差(n=3)

2.6 线性范围和检出限

通过选取500、250、50、25 μg/ml和1 μg/ml五个点，考察了此范围内香芹酚和百里香酚的线性。香芹酚和百里香酚的线性方程和R2分别是y=22 848x-123 367，0.994；y=23 913x-148 905，0.993，说明在500 μg/ml到1 μg/ml的范围内，香芹酚和百里香酚的浓度与仪器响应呈良好的线性相关。以仪器噪声3倍计算，香芹酚和百里香酚的仪器检出限为0.8 μg/ml；按照实际添加回收率试验，香芹酚和百里香酚方法定量限为10 mg/kg。