莲叶体外发酵指标测定

■包淋斌

(江西农业大学江西省动物营养重点实验室营养饲料开发工程研究中心，江西南昌 330045)

莲叶（Lotus Leaf）别名荷叶、鲜荷叶、干荷叶、荷叶炭，广昌县自古以来就被称为“莲乡”，白莲的种植和加工历史非常悠久，16世纪初明正德《建昌府志》和19世纪中期清同治《广昌县志》就有记载，广昌白莲入选中国国家地理标志产品。莲子又名水芝丹，是我国水生蔬菜栽培中的特种挺水宿根经济植物,属睡莲科莲属(Nympheaceae Nelumbo Adans)。荷叶资源在我国种植面积广泛，是一种常见的中药材料，集中分部在黄河、长江流域，其中浙江、福建、湖北、湖南、江西为主要产地。荷叶采收时间分布6月到10月初，夏季和秋季采集，晒凉并干燥荷叶，含水量至10%～20%，置放于通风处储存，防止发霉和虫蛀。荷叶目前主要研究在食用方面及药用方面，如降脂保健、抑制自由基、食用和抑制病毒等方面。本试验采用上世纪70年代末期Menke等提出体外人工胃液培养法，该方法在国内外普遍用于评定饲料营养价值，国外称该方法为HFT技术。与体内法相比，体外培养法简单易行，试验动物数量要求少，可重复性好，可批次操作，适合大量样品分析，而且与体内试验相关性高。其原理是将饲料样品置于含有瘤胃液培养液中，培养过程中会产生CO2、CH4等气体，产气量和饲料在动物体内消化率之间存在相关性，因此，可以根据产气量来预测饲料的消化率。本试验采用体外发酵法探讨莲叶在锦江黄牛体外发酵指标情况，旨在为科学利用粗饲料促进瘤胃发酵和肉牛生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 原料来源及制备

莲叶为自然晒干样，采购自广昌县周边农户，品种为白花莲。以“四分法”采取样品，于65℃烘干12 h，粉碎后过40目筛用于饲料常规营养成分分析及用于体外发酵试验。各营养成分根据《饲料分析与饲料质量检测技术》的方法进行测定。

1.2 试验动物、日粮及饲养管理

选用江西农大动物营养试验基地3头体重（BW）为(300±20)kg，安装有永久性瘤胃瘘管的健康锦江黄牛。试验动物每天饲喂2次（8：00和18：00），先粗后精，自由饮水，用于采集瘤胃液。基础日粮为玉米-麦麸-苔草型，其精粗比为4∶6，满足反刍动物营养需求，精料购置江西华大牧业，苔草采购于江西鄱阳湖草业开发有限公司。瘤胃液供体牛日粮组成及营养水平见表1。

表1 瘤胃液供体牛日粮组成及营养水平

1.3 试验设计与方法

试验分对照组及试验组，试验组添加培养底物0.5 g莲叶而对照组不加，每组设6个重复。体外产气装置参照卢德勋和程茂基的方法进行。该装置主体为恒温水浴摇床，其水浴温度和震荡频率可调。选用150 ml带橡皮塞的酸奶瓶作为培养瓶，橡皮塞上接有带三通阀的橡胶管，三通阀一端与带刻度注射器相连。

1.4 人工培养液的配置

A液：称取K2HPO4382.51 mg，KH2PO4292 mg，(NH4)2SO4480 mg，NaCl 200 mg，MgSO4·7H2O 100 mg和Na2CO34 000 mg。将上述试剂混合后加入蒸馏水定容至1 000 ml。该溶液使用前1 d配制待用。

B液：准确称取EDTA 500 mg，FeSO4·7H2O 200 mg，MnCl·4H2O 200 mg，ZnSO4·7H2O 10 mg，H3BO330 mg，CoCl2·6H2O 20 mg，CuCl2·6H2O 1 mg，NiCl2·6H2O 2 mg和NaMoO43 mg。将上述试剂混合后加蒸馏水定容至1 000 ml。持续通入CO218 h后，盖严瓶口，至于冰箱备用。

C液：称取25 gNa2S·9H2O加入80 ml蒸馏水溶解后定容至100 ml，持续通入CO220 min后，盖严瓶口，置于冰箱中备用。

培养液制备：准确量取790.4 ml A液，8 ml B液，经充分混和后持续通入CO218 h，并于培养前1 h加入1.6 ml C液，充分混合。

1.5 瘤胃液的采集

晨饲前在3头试验牛瘤胃内上下左右不同位点采集瘤胃液，灌入39℃并通有CO2的灭菌广口瓶中，广口瓶置于装有39℃蒸馏水的保温瓶中。采集完后迅速返回试验室，经4层纱布过滤后持续通入CO2气体5 min，然后迅速分装至装有培养底物和人工培养液的培养瓶内，每个培养瓶加20 ml瘤胃液，人工培养液40 ml。混合均匀后打开三通阀和振荡开关，开始培养。

1.6 样品的采集与分析

培养24 h后，记录产气量，立即用pH计测定pH值。将培养物用纱布过滤，滤渣无损失地转移入100 ml大坩埚中，测定干物质消化率。滤液转移至100 ml离心管中，1 500 r/min离心15 min，以去除原虫和饲料大颗粒，然后分装至10 ml EP管中。分别用三氯乙酸沉淀法和冯宗慈比色法测定BCP浓度和NH3-N；VFA的测定采用GC-1690气相色谱仪（杭州科晓化工仪器设备有限公司）FID检验器，OV-1701型毛细管（30 m×0.32 mm×0.5 μm），2000色谱数据工作站，内标分析法，内标物为巴豆酸。采用程序升温，初温80℃，初时3.5 min，升速30℃/min，终温180℃，终时10 min；进样室温度260℃，检测器温度260℃；柱前压力0.05 MPa，氮气作为载气。样品进样量1 μl。

1.7 数据处理

本试验数据统计处理采用spss17.0和EXCEL 2003进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 莲叶各营养成分（见表2）

表2 莲叶常规营养成分

2.2 莲叶体外培养发酵指标（见表3）

由表3可见：试验组干物质消化率（59.13%）高于对照组干物质消化率（48.75%），说明莲叶具有较高饲用价值；试验组产气量(43.5 ml)高于对照组产气量（30 ml）；试验组瘤胃菌体蛋白含量（5.93 mg/100 ml）高于对照组（4.06 mg/100 ml）；试验组氨态氮产量(8.78 mg/100 ml)高于对照组（8.36 mg/100 ml）；试验组pH值(5.86)低于对照组（6.06）；试验组VFA产量(28.31 mmol/l)高于对照组（21.48 mmol/l）；试验组支链脂肪酸产量(0.44 mmol/l)与对照组（0.44 mmol/l）产量相等；试验组乙酸/丙酸比值(1.98)低于对照组（2.43）；试验组乙酸产量（16.87 mmol/l）高于对照组乙酸产量（13.34 mmol/l）；试验组丙酸产量（8.53 mmol/l）高于对照组丙酸产量（5.49 mmol/l）；试验组丁酸产量（2.47 mmol/l）高于对照组丁酸产量（2.21 mmol/l）；试验组异丁酸产量（0.25 mmol/l）高于对照组异丁酸产量（0.22 mmol/l）；试验组异戊酸产量（0.19 mmol/l）低于对照组异戊酸产量（0.22 mmol/l）。

表3 莲叶体外培养发酵指标

3 讨论

瘤胃pH值是一项反映瘤胃发酵水平最基本、最重要的指标之一,对维持瘤胃内环境相对恒定起到主导作用。pH值受很多因素的影响，如唾液分泌、VFA的吸收和排出速度等，其波动根本原因则是日粮结构和营养成分。适宜pH值才可使瘤胃正常发酵。国内外很多学者对于瘤胃微生物最适宜的生长范围有许多研究，一般认为瘤胃原虫、厌氧性真菌和细菌最适pH值为5.8、7.5和6～7。纤维素消化最适pH范围6.0～6.8。VFA形成适宜pH范围6.2～6.6。蛋白质合成最佳pH值范围6.3～7.4。NH3-N利用最适pH值范围5.7～6.2。本试验结果表明：试验组pH值（5.86）低于对照组（6.06），由于没有瘤胃壁对酸的流入和排出，唾液的分泌也不存在，随着时间延长人工培养液逐渐失效，因此导致pH值偏低。

在反刍动物中，瘤胃微生物将日粮中的蛋白分解为小肽、氨基酸和氨等多种形式的氮，然后在碳水化合物等营养物质的供应下，将这些氮合成微生物蛋白，然后进入后消化道进行消化、吸收和利用。因此，瘤胃中BCP是反刍动物蛋白质营养最重要来源，能提供蛋白质需要的40%～80%。菌体蛋白浓度高低从侧面反映发酵系统中微生物种群的数量及氨态氮的使用情况。本试验结果表明：试验组菌体蛋白浓度（5.93 mg/100 ml）高于对照组（4.06 mg/100 ml）,试验组有利于瘤胃微生物蛋白质合成。Mc Allan等（1994）研究发现提高粗蛋白降解可以增加菌体蛋白合成，本试验因莲叶粗蛋白含量高（19.10%），促进菌体蛋白合成。

VFA含量是瘤胃发酵的主要指标之一。反刍动物瘤胃发酵产生VFA约占进入机体代谢的碳流量的2/3,可提供总能量需要量的70%～80%。VFA的含量及比例可大致反映瘤胃内的发酵类型和吸收状况。VFA的产量和比例和许多因素有关：①瘤胃微生物种类及数量改变也会影响VFA产量及比例，不同种类的微生物对底物的发酵类型及代谢途径都不相同，不同饲喂条件下，瘤胃微生物组成和数量也会改变；②瘤胃内环境改变也会改变VFA产量及比例；③不同底物发酵其VFA产量及比例也会不同。本试验结果表明：试验组VFA产量高于对照组，莲叶做体外发酵底物有利于瘤胃VFA的合成。

乙酸/丙酸比例是反映瘤胃发酵类型和能量利用率的主要指标，乙酸/丙酸比例越低，说明瘤胃朝丙酸型发酵，反刍动物能量利用效率就越高。丙酸为主要生糖VFA，对于育肥牛丙酸产量高较好。乙酸是合成脂肪的前体物质，奶牛生产中乙酸产量高较好。本试验表明：试验组乙酸/丙酸比值低于对照组，说明瘤胃朝丙酸型发酵，瘤胃对莲叶中能量利用率较高，莲叶在瘤胃中发酵消化较快。

反刍动物瘤胃内NH3-N是重要的中间产物，是微生物合成菌体蛋白的主要氮源，氨态氮主要来源是饲料重含氮物质的发酵，瘤胃氨氮浓度反映氮源供应情况。瘤胃纤维降解细菌生长需要NH3-N刺激，当饲料中氮过低，会导致瘤胃微生物特别是纤维分解菌生长不好，导致瘤胃发效率降低，纤维分解效率下降，微生物蛋白合成受阻，当含氮物质过高，超过微生物利用最大能力，导致氮源浪费，严重还会导致动物氨中毒。Satter等(1974)研究表明，5 mg/100 ml为瘤胃氨态氮浓度最低标准，小于这个浓度，瘤胃微生物不能正常生长。Wanapat等（1998）研究表明5～28 mg/100 ml内氨态氮浓度适宜瘤胃微生物生长。本试验氨态氮浓度在此范围内，试验组高于对照组，说明莲叶提供氮源充足，微生物生长较好。

支链脂肪酸(BCFA)是瘤胃内纤维分解菌的生长因子,可提高纤维分解菌的数量,促进纤维消化。瘤胃中支链脂肪酸主要来源于蛋白质降解后氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)经氧化脱氨基或脱羧基后的产物。本试验表明：试验组支链脂肪酸与对照组相等，说明莲叶为体外培养底物不能促进纤维消化。

4 小结

4.1 莲叶体外培养法测得干物质消化率高达59.13%,说明莲叶具有较高饲用价值。

4.2 莲叶能提高瘤胃发酵功能，促进瘤胃微生物蛋白质合成和瘤胃挥发性脂肪酸的产生，促进瘤胃丙酸型发酵。

（参考文献25篇，刊略，需者可函索）