大孔树脂吸附马比木中喜树碱的工艺

2015-01-18罗娅君边清泉闵昌松

中成药 2015年8期

关键词：样液大孔蒸馏水

罗娅君，边清泉，罗英，闵昌松

（绵阳师范学院化学与化学工程学院，四川绵阳621000）

大孔树脂吸附马比木中喜树碱的工艺

罗娅君，边清泉，罗英，闵昌松

（绵阳师范学院化学与化学工程学院，四川绵阳621000）

目的研究大孔吸附树脂吸附马比木中喜树碱的纯化工艺条件及吸附参数。方法利用高效液相色谱（HPLC）法测量马比木中喜树碱的含有量，以喜树碱吸附率和解析率为指标，通过静态饱和吸附与解吸试验对3种型号树脂进行筛选，再通过动态吸附与解吸试验对吸附工艺参数进行全面优化。结果AB-8型大孔吸附树脂对马比木中喜树碱的吸附与解析性能较好（静态吸附率为93.97%，解析率为75.00%）。最佳吸附条件为：喜树碱检测波长为253 nm，样品液中喜树碱的质量浓度为0.087 mg/mL，含有量为7.25 mg/g。样品液体积流量为0.5 mL/min，样品液pH8，洗脱剂为80%乙醇，马比木喜树碱解析率为86.34%。结论AB-8型大孔吸附树脂可有效吸附马比木中喜树碱，为马比木资源的综合开发利用提供科学的依据，建立良好的理论基础。

马比木；喜树碱；大孔吸附树脂；高效液相色谱

马比木Nothapodytes Pittosporoides（O1iv.）s1eum系茶茱萸科植物海桐假柴龙树，又名海桐马比木、海桐假柴龙树、追风伞、公黄珠子等。马比木全草入药，是一种重要的药用植物，其功能表现为活血止痛、祛风通络，主治小儿惊风、半身不遂、风湿痹痛、跌打损伤以及浮肿等［1］，为多年生草本，分布于湖北、湖南、四川及贵州等地［2］。它的根部主要含喜树碱及其甲基衍生物，在临床上被用于消化系统恶性肿瘤的治疗［3-4］。随着市场对喜树碱及其衍生物的需求量的增长和国家对喜树植株的重点保护，马比木作为喜树碱新药源的替代品，已越来越受到研究者青睐。据报道，马比木根中喜树碱的含有量高于喜树果中喜树碱的含有量［5-8］，其根茎中所含喜树碱的含有量最高可达0.392%，而喜树果中喜树碱的含有量较低，四川地区最高含有量为0.118%，福建地区最高含有量为0.190%［9］。

大孔吸附树脂分离技术是继离子交换树脂后发展起来的一种新型分离新技术，克服了离子交换树脂易污染、耗酸量大等缺点。近年，它在中药复方的制备、中药制剂的生产以及中草药有效成分的提取分离方面日益受到重视［10-12］。目前，未见有关大孔吸附树脂吸附马比木中喜树碱的工艺研究，为了合理利用自然资源和保护自然资源，同时提高喜树碱的产量，本实验选用3种不同型号的大孔吸附树脂，分别探索了它们对马比木中喜树碱的吸附和解析效果，找到吸附率与解析率最佳的大孔树脂，并对该大孔树脂做动态吸附实验，确定其最佳的工艺条件，为马比木资源的综合开发利用提供科学的依据，并建立良好的理论基础。

1 材料与仪器

SHZ-8水浴恒温振荡器（上海贺德实验设备有限公司）；AUY120电子天平（日本岛津公司）；As-10200T超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；岛津高效液相色谱系统，包括LC-20A T输液泵，SPD-10AUP二极管阵列检测器，CLASS-vp5.0色谱数处理工作站，CTD-6A色谱柱温箱（日本岛津公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FW-177中草药高速粉碎机（天津市泰斯特仪器由有限公司）。

喜树碱对照品（上海永恒生物科技有限公司，经高效液相分析纯度为99.6%）；马比木根（采自贵州），经鉴定为茶茱萸科植物海桐假柴龙树Nothapodytes Pittosporoides（O1iv.）s1eum.的根；D101型大孔吸附树脂（成都市科龙化工试剂厂）；AB-8型大孔吸附树脂、S-8型大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 喜树碱的测定

2.1.1 喜树碱标准溶液的配制取喜树碱对照品2.6 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，定容并摇匀，得104μg/m L喜树碱标准溶液，放于冰箱中冷藏。

2.1.2 检测波长的确定精密吸取10μL的喜树碱标准溶液，测得其紫外分光光谱图。由光谱图可知，喜树碱分别在218 nm、254 nm和360 nm三处有强吸收，但是在218 nm波长处存在不明组分的吸收，将会干扰实验的测定，在360 nm波长处，其吸收强度不如在254 nm波长处强。所以选择检测波长为254 nm。

2.1.3 色谱条件［13］色谱柱为Diamonsi1TMC18（5μm，4.6 mm×250mm），流动相为甲醇-水（5.5∶4.5），体积流量0.9mL/min，检测波长为254 nm；柱温为35℃；进样量为10μL。分离度大于1.5；灵敏度为0.050AUFS；理论板数按喜树碱计算均大于4500。

2.1.4 标准曲线绘制［13］分别精密吸取 “2.1.1”项制备的标准溶液1、3、5、7、9μL，按上述色谱条件进样，测定峰面积，以对照品溶液进样量（μg）为横坐标，以峰面积均值（μv.s）为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=1.619 9×106X-19 573.3（r=0.999 9），结果表明喜树碱在0.2～1.8μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.1.5 样品液的配制马比木根自然晒干粉碎，过60目筛得马比木粉末。取100 mL锥形瓶，加入准确称取的3.0 g样品，再加入80 mL的甲醇在25℃条件下超声提取，每次超声30min，超声2次，将两次的提取液减压过滤，滤液转入250mL量瓶中，用甲醇定容，并放于冰箱中冷藏。

精密吸取提取液10μL，注入高效液相色谱仪，连续进样2次，用外标法计算样品溶液中喜树碱的质量浓度，取平均值。250 mL样品液中喜树碱的质量浓度为0.087 mg/m L，喜树碱的含有量为7.25 mg/g。对照品和马比木粗提物的HPLC色谱图分别见图1、图2。

图1 对照品喜树碱的HPLC色谱图

图2 马比木粗提物HPLC色谱图

2.2 大孔树脂静态吸附和解吸

2.2.1 大孔吸附树脂的预处理分别称取D101、AB-8、S-8型大孔吸附树脂各2.0 g，根据文献和3种树脂的性质进行预处理［14-16］。

D101：先用无水乙醇浸泡24 h，湿法装柱，再用95%乙醇淋洗树脂柱至流出液加水不混浊，然后用蒸馏水淋洗至无醇味，用蒸馏水浸泡待用。

AB-8：湿法装柱，95%乙醇洗至流出液加水不浑浊，用蒸馏水淋洗树脂柱至流出液无醇味，再用4%NaOH溶液2-3床体积淋洗树脂，然后用蒸馏水淋洗树脂柱至流出液为中性，用蒸馏水浸泡待用。

S-8：无水乙醇浸泡3～4 h，湿法装柱，用95%乙醇淋洗树脂柱至流出液不浑浊，再用蒸馏水淋洗树脂柱至流出液无醇味，蒸馏水浸泡待用。

2.2.2 树脂的再生树脂柱用蒸馏水淋洗至流出液无醇味，控制体积流量1～2 BV/h（BV表示床体积的倍数，即所用淋洗液的体积等于床体积的倍数），用3%HC1溶液淋洗树脂柱2～4 h，再用蒸馏水淋洗至流出液呈中性，控制体积流量1～2 BV/h，然后用5%NaOH溶液洗树脂柱2～4 h，最后用蒸馏水淋洗至流出液呈中性，蒸馏水浸泡树脂，即可继续使用。

2.2.3 静态吸附和解吸准确移取10mL马比木提取液于100 mL带塞的锥形瓶中，平行移取3份，分别加入通过预先处理好的D101、AB-8、S-8型大孔吸附树脂各2.0 g，置于20℃，摇速恒定的水浴恒温摇床中吸附24 h，抽滤得滤液（抽滤后的树脂用于静态解析），取滤液1 mL于比色管中，用甲醇稀释至10 mL，HPLC测定吸附液的浓度，用下式计算吸附量和吸附率。

吸附量=（C0-C1）

吸附率=（C0V0-C1VI）/C0V0×100%

式中，C0为吸附前溶液中喜树碱的质量浓度，μg/mL；C1为吸附后溶液中喜树碱的质量浓度，μg/mL；V0为吸附前溶液的体积，mL；V1为吸附后溶液的体积，mL。

取静态吸附抽滤后的树脂分别加入到100 mL具塞的3个锥形瓶中，再分别加入20 mL体积分数为95%乙醇，置于20℃，摇速恒定的水浴恒温摇床中解析24 h，抽滤得到滤液，取滤液1 mL于比色管中，HPLC测定解析液质量浓度，用下式计算解析率。

解析率=C2V2/（C0V0-C1V1）×100%

式中，C0、C1、V0、V1同上，C2为解析液中喜树碱的质量浓度（μg/mL）；V2：解析液的体积（m L）。3种大孔吸附树脂对喜树碱的静态饱和吸附率和解析率如表1。

表1 3种大孔树脂对喜树碱的静态吸附和解吸情况

在考察大孔树脂对喜树碱的静态吸附与解析效果时，主要考虑其极性、比表面积、孔径不同以及喜树碱的分子体积等因素。这些因数的共同作用使得大孔树脂对喜树碱的吸附能力的强弱不同，解吸程度也存在着差别。为了保证最大程度地提取天然药物中的有效成分，对大孔吸附树脂的要求不仅要达到吸附率高，而且还要满足解吸率高。表1表明，D101、AB-8型大孔吸附树脂对喜树碱的吸附率都较大。D101的吸附率最大，但解析率较低，综合考虑吸附量与解析率，AB-8树脂性能最佳，故优选AB-8树脂来进一步研究其对喜树碱的富集纯化工艺。

2.3 AB-8动态吸附和解吸

2.3.1 上样液体积流量对大孔吸附树脂吸附率的影响取树脂柱，湿法装入已经预处理过的AB-8型大孔吸附树脂2.0 g，准确移取上样液10 mL上柱，调节体积流量分别为0.5、1、2、2.5、3.5mL/min进行吸附，用洁净干燥的锥形瓶接收流出液。分别取1mL流出液于比色管中，用甲醇稀释至10 mL，HPLC法测定吸附液的浓度，不同体积流量下树脂的吸附率见图3。

图3 不同体积流量对吸附率的影响图（n=3）

在生产工艺中考虑到生产成本，一般控制体积流量在0.5～5 mL/min。由图3可知，样品液的体积流量越小，大孔树脂的吸附率越大，但是体积流量过小，消耗的时间越长。综合考虑吸附率与吸附时间，当上样液体积流量为0.5mL/min时，大孔树脂对喜树碱的吸附率达到94.62%，同时吸附时间也较合适。所以，选择控制上样液为体积流量0.5 m L/m in。

2.3.2 上样液pH对大孔吸附树脂吸附率的影响取树脂柱，湿法装入已经预处理过的AB-8型大孔吸附树脂2.0 g，准确移取4份上样液各10mL，2份用5%HC1溶液调pH为3、5，2份用4%NaOH溶液调pH为8、10，控制体积流量0.5 mL/min对其吸附，用洁净干燥的锥形瓶接收流出液。分别取1 mL流出液于比色管中，用甲醇稀释至10 mL，HPLC法测定吸附液的浓度，不同pH下树脂的吸附率见图4。

图4表明，随着上样液pH的增加，吸附率逐渐增大。喜树碱在碱性条件下会生成相应的羧酸盐，增加了大孔树脂对它的吸附量，但是考虑到喜树碱钠盐的不稳定性。所以，选择调节上样液的pH=8。

图4 上样液pH对吸附率的影响图（n=3）

2.3.3 洗脱剂乙醇体积分数对解析率的影响树脂柱湿法装入已经预处理过的AB-8型大孔吸附树脂2.0 g，准确移取上样液10 mL，调节pH=8和控制体积流量为0.5 m L/m in对其吸附。用20 mL体积分数分别为50%、60%、70%、80%、95%的乙醇洗脱树脂柱，用洁净干燥的锥形瓶接收洗脱液。各取1 mL洗脱液于比色管中，用甲醇稀释至10 m L，HPLC法测定解析液的浓度，不同体积分数下乙醇对喜树碱的解析率见图5。

图5 不同体积分数的乙醇对喜树碱的洗脱效果图（n=3）

从图5可以看出，随着乙醇的体积分数增加，对喜树碱的解析率也不断增大。当乙醇的体积分数为80%时，喜树碱的解析率最高为86.34%，所以选择80%的乙醇作为洗脱剂。

2.3.4 验证试验取3根树脂柱，AB-8树脂湿法装柱，pH为8的上样液10mL上柱，控制体积流量为0.5mL/min对其吸附。80%的乙醇洗脱树脂柱，用洁净干燥的锥形瓶接收洗脱液。HPLC测得3次实验的喜树碱质量分数分别为46.9%、45.9%、46.4%，平均质量分数为46.4%，说明该工艺对喜树碱有较好的富集纯化作用。

3 讨论

本实验用静态与动态吸附法筛选出了适合马比木中喜树碱分离的大孔树脂，实验结果表明AB-8型大孔树脂是一种比较理想的树脂，对喜树碱的吸附量大，解析率高，适合喜树碱的分离纯化。当10 mL上样液的体积流量为0.5 mL/min、pH 8、20mL 80%乙醇作为洗脱剂时，纯化后喜树碱的质量分数为46.4%。大孔树脂法操作简单，成本低廉，经过大孔树脂纯化后喜树碱高度富集，杂质减少，该工艺能为马比木的开发利用奠定基础，促进喜树碱抗癌药物的开发和研究，有利于自然资源的充分利用和可持续发展。

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