酪酸梭菌抗阿司匹林致小鼠胃溃疡作用的初步研究

沈淑蓉 朱静 张浩 曾静静 付瑶阳 王雅琪 王方岩

酪酸梭菌抗阿司匹林致小鼠胃溃疡作用的初步研究

沈淑蓉 朱静 张浩 曾静静 付瑶阳 王雅琪 王方岩

目的钼观测酪酸梭菌是否对阿司匹林导致的胃溃疡具有预防效应，并对其机制进行初步探讨。方法钼取30只健康雄性ICR小鼠，随机分成3组，每组各10只，即模型组、酪酸梭菌组、奥美拉唑组。酪酸梭菌组以6×108c fu/只的菌量，模型组和奥美拉唑组均予以相同体积的无菌培养基，灌胃4d后再饥饿处理48h，然后以250mg/kg剂量的阿司匹林灌胃造模，奥美拉唑组小鼠于造模前30m in，腹腔注射奥美拉唑（13mg/kg）。造模4h后，取胃组织分别测定SOD、CAT活力、MDA含量；进行常规HE染色观察胃黏膜组织结构变化，PAS染色判断黏液量的变化，免疫组化法测定Bc l-2、Bax表达水平。结果 模型组的SOD、CAT活性明显降低，MDA含量显著增加，而酪酸梭菌预处理后逆转了该趋势（P＜0.01），与奥美拉唑组比较无统计学差异。HE染色观察，酪酸梭菌能减轻胃黏膜的病理损伤，与奥美拉唑组无统计学差异。PAS结果提示酪酸梭菌能够增加黏液量。酪酸梭菌组的Bc l-2表达较模型组显著增多，同时Bax表达显著减少。结论 酪酸梭菌预处理通过抗氧化应激、增加胃黏液量、上调Bc l-2/Bax表达比例，减轻阿司匹林造成的胃溃疡损伤。

酪酸梭菌 阿司匹林 胃溃疡 氧化应激

胃溃疡（gastric ulcer，GU）是最为常见的胃部疾病，其发病率高，在造成胃黏膜损伤的诸多原因中，以非甾体抗炎药物（non-steroidalanti-inflammatory drug，NSAID）的广泛应用最为突出[1-3]，其中阿司匹林对胃黏膜的直接损害作用最为显著。如何防治该类GU的发生与复发，仍是广大研究人员所面对的重大课题。酪酸梭菌（Clostridium butyricum，C.butyricum）是专性厌氧的革兰阳性芽胞杆菌，1933年由日本宫入近治博士首次发现。其形态呈直杆状或稍有弯曲，中间轻度膨隆，两端钝圆，是一种存在于人和畜禽肠黏膜内的益生菌。其在人体肠道内可促进多种有益菌群的增殖，抑制有害菌和腐败菌的生长、繁殖，改善肠道内的微生态环境，减少肠毒素的产生。在临床应用中，酪酸梭菌治疗肠道菌群紊乱引起的肠炎、腹泻、消化不良等疾患，取得了显著疗效[4-6]。在胃部疾病的治疗中，酪酸梭菌已被用于拮抗幽门螺杆菌，且效果颇佳，但该菌对胃黏膜是否具有直接的保护作用，仍未有探讨。本实验旨在探索酪酸梭菌能否预防阿司匹林导致的GU，希望由此改善阿司匹林的不良反应，并且对酪酸梭菌在GU直接防治方面，提供更有力的支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 本实验室保藏酪酸梭菌株（CGMCC NO. 8808）

1.1.2 液体培养基（TPY培养基） 水解酪蛋白10g/L，植物胨5.0g/L，酵母粉2.0g/L，葡萄糖5.0g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，氯化镁0.5g/L，硫酸锌0.25g/ L，氯化钙0.15g/L，氯化铁0.0001g/L，吐温80 1.0g/L，pH 6.5±0.1。

1.1.3 试剂 注射用奥美拉唑钠（江苏奥赛康药业股份有限公司），BCA蛋白定量试剂盒丙二醛（MDA）测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），PAS染色试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），阿司匹林（美国Sigma公司），Bcl-2多克隆抗体（美国Biovision公司），Bax多克隆抗体（美国Cell signal公司），免疫组化试剂盒（北京中杉公司）。

1.1.4 动物 ICR小鼠30只，雄性，体重（25.0±2.0）g，购自温州医科大学实验动物中心，按随机数字表法分成3组，每组各10只。

1.2 方法

1.2.1 酪酸梭菌活化与传代 取酪酸梭菌活化后将培养基置于37℃厌氧培养箱中培养20h，菌的浓度达2× 109cfu/ml。

1.2.2 造模 酪酸梭菌组灌胃0.3ml酪酸梭菌培养液/只；模型组和奥美拉唑组均灌胃相同体积的无菌培养基，处理4d后饥饿48h，以250mg/kg剂量的阿司匹林灌胃造模[7]。奥美拉唑组造模前30min腹腔注射奥美拉唑13mg/kg。

1.2.3 胃组织获取 将小鼠颈椎脱臼处死，分别结扎贲门，幽门端后取胃，每组4只鼠胃置于10%甲醛中固定15min，沿胃大弯剪开，0.9%氯化钠溶液冲洗，滤纸吸干水分，拍照。保存至甲醛溶液中，用于后期组织切片与染色观察；剩余胃组织（每组6只）用冰0.9%氯化钠溶液洗净，存于-80℃冰箱，用于后续SOD、CAT、MDA指标测定。

1.2.4 溃疡面积测定 将上述固定胃组织展开平置用扫描仪扫描，通过软件Image-Pro Plus（IPP）6.0测量胃组织的总面积及出血溃疡面，并计算两者的相对面积比例。

1.2.5 HE染色 将固定后的胃组织进行常规脱水石蜡包埋，制成病理切片，切片厚度约为5μm，HE染色在光镜下观察胃黏膜的组织学变化。

1.2.6 PAS染色 将石蜡包埋的胃组织标本切片后，行常规PAS染色，在光镜下观察胃黏膜的黏液变化情况。

1.2.7 氧化还原指标测定 取出冻存胃组织称重，用冰0.9%氯化钠溶液制成10%胃组织匀浆，4℃2 500r/min× 10min，离心取上清液，采用双缩脲蛋白质定量（BCA）法进行蛋白定量，检测并计算以下各氧化还原指标单位含量。（1）SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧自由基，后者氧化羟氨形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，显色后于550nm处有最大吸收峰[以吸光度（A）表示]。具体操作按试剂盒说明书进行。（2）CAT活力测定采用H2O2法：过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应可通过钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生淡黄色的络合物，在405nm处测定生成量，可以利用对照管和测定管的A值差异即可求出每毫克蛋白CAT活力（U/mgprot）。具体操作按试剂盒说明书进行。（3）MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法：MDA与TBA缩合，生成红棕色产物，在532 nm处有最大吸收峰。根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度（μmol/mgprot）。具体操作按试剂盒说明书进行。

1.2.8 免疫组化法测定Bcl-2、Bax表达 将组织切片常规脱蜡后，行枸橼酸抗原修复。分别用Bcl-2（1∶80）、Bax（1∶200）一抗4℃孵育过夜，滴加二抗室温2h后，DAB工作液显色，在显微镜下观察，当出现特异性显色时用蒸馏水终止反应，苏木素复染10s左右，PBS返蓝。最后脱水、透明、中性树脂封片。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，测得计量资料采用表示，方差齐性者采用LSD法分析，不齐者采用Tamhane’s T2分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 小鼠胃黏膜损伤情况 见图1-2。

由图1可见，模型组的胃黏膜表面出血明显，呈弥散性。但经酪酸梭菌预防性处理后，黏膜损伤显著减轻，与奥美拉唑的效果相似。

由图2可见，经PPI软件计算所得的溃疡指数，也提示模型组黏膜溃疡显著，而酪酸梭菌与奥美拉唑预处理后溃疡指数得到明显改善（均P＜0.01）。

图1 各组小鼠胃黏膜标本形态（A：模型组；B：酪酸梭菌组；C：奥美拉唑组）

图2 各组胃黏膜溃疡指数变化

2.2 小鼠胃黏膜HE染色光镜观察 见图3。

图3 各组小鼠胃黏膜HE染色病理图（A：模型组；B：酪酸梭菌组；C：奥美拉唑组；×200）

由图3可见，模型组胃黏膜严重缺损，局部坏死脱落，腺体破坏严重。酪酸梭菌组和奥美拉唑组胃黏膜组织较完整，腺体排列较整齐，有少量炎症细胞浸润。

2.3 小鼠胃黏膜PAS染色光镜观察 见图4。

图4 各组小鼠胃黏膜PAS染色病理图（A：模型组；B：酪酸梭菌组；C：奥美拉唑组；×200）

由图4可见，模型组胃黏膜黏液层明显变薄。与模型组相比，酪酸梭菌组与奥美拉唑组黏液层显著增厚，酪酸梭菌组PAS甚至略优于奥美拉唑组。

2.4 各组胃组织的SOD、CAT活性及MDA含量变化见表1。

表1 各组胃组织的SOD、CAT活性及MDA含量变化

由表1可见，阿司匹林处理后，胃组织内的SOD、CAT活性明显降低，而MDA含量显著升高，在酪酸梭菌预处理后，以上这些变化都得到明显改善（均P＜0.01）。酪酸梭菌组的各项指标较奥美拉唑组无统计学差异。

2.5 胃组织Bcl-2、Bax表达情况 见图5。

图5 各组胃组织Bcl-2，Bax免疫组化（上排：Bcl-2，下排：Bax；A：模型组，B：酪酸梭菌组，C：奥美拉唑组，×200）

由图5可见，模型组Bcl-2的表达呈阴性或弱阳性，Bax呈强阳性。酪酸梭菌处理后Bcl-2显著升高、Bax明显下降，而奥美拉唑组Bcl-2、Bax的表达基本都呈阴性或弱阳性。

3 讨论

阿司匹林是临床上广泛应用的NSAID类药物，常用于预防及治疗风湿性关节炎和血栓性心血管病。随着人口老龄化的加剧，此类疾病日益增多，阿司匹林的应用越来越广泛，由其诱发的GU亦愈发常见。环氧合酶（COX）能够促进胃黏液分泌，增强胃的屏障作用，而阿司匹林抑制了COX，从而削弱了胃黏膜的屏障功能，造成胃对损伤因素的易感性[8]。在此过程中，有炎症因子的参与如IL-1β、TNF-α等[9]，活性氧族（reactive oxygen species，ROS）也是重要的损伤因素[10]。

阿司匹林复制的小鼠GU模型，与患者服用NSAID类药物造成的GU，在发病机制及临床表现方面都有高度的拟合性。该模型是研究NSAID造成GU的机制及筛选防治药物的良好模型[11]。本研究中，我们也成功复制该模型，并发现明显的病理损伤及氧化应激，这与以往的研究相一致[10]。

在本研究中，酪酸梭菌预处理后，能够较明显的缓解阿司匹林所造成GU。肉眼观察及病理切片结果显示，酪酸梭菌减轻了胃黏膜的损伤程度。阿司匹林造成的SOD、CAT含量活性降低以及MDA升高，经酪酸梭菌预处理后也得到明显改善。该结果提示，酪酸梭菌可能通过减轻氧化应激实现对胃黏膜的保护作用。在非酒精性肝病的研究中，酪酸梭菌可减少由肝病引起的ROS产量，实现对肝脏的保护效应[12]。PAS染色的结果提示酪酸梭菌能够促进胃黏液的产生，从而保护胃黏膜，这是临床现行的GU治疗措施所不具备的特性，在将来的研究中可以更深入的阐述其机制，为临床应用提供理论基础。免疫组化的结果提示酪酸梭菌具有上调Bcl-2/Bax比例的能力，提示该菌能够由此发挥抗凋亡作用。

正常人胃液的pH值为1.5～2.0，胃液里的盐酸可以杀死随食物进入胃内的细菌[13]，因此鲜有细菌能在胃内定植。但酪酸梭菌具有较强的抗酸能力，有学者已发现该菌能够在小鼠胃内定植[14]，本研究则发现该菌能从多层面多角度对胃黏膜实施的保护作用，该特点是其他益生菌很难企及的。酪酸梭菌的这种显著效应可能与其代谢产物有关，已有多个中心证实该菌两个主要代谢产物丁酸和氢气均是较为有效的抗氧化物质，而且丁酸是典型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能够调节基因的表达，这很可能是酪酸梭菌改变Bcl-2/Bax比例的主要原因[15-16]。

该菌是临床上常规使用的益生菌，广泛用于治疗肠炎、腹泻、消化不良等疾患，若在临床研究中也能够证实其对胃黏膜的直接保护效应，将是广大NSAID服用者的福音。

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Clostridium butyricum prevents gastric ulcer induced by aspirin in mice

SHEN Shurong,ZHU Jing,ZHANG Hao,et al.Department of Oncology,Wenzhou Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the effectof Clostridium butyricum(C.butyricum)in p revention ofgastric ulcer(GU) induced by asp irin in m ice.Methods Thirty ICRm ice were random ly d ivided intomodelg roup,bacteria g roup andomep razole g roup(n=10/g roup).After starvation for 48h,m ice were given orally w ith 250mg/kg asp irin to estab lish GU model.Mice in bacteria g roup were orally p retreated w ith C.butyricum 6×108c fu for 4d before starvation,while m ice in model g roup and omep razole g roupwere given the samevolume ofsterile culturemedium.Mice in omep razole g roup were intraperitoneally injec ted w ith 13mg/kg omep razole 30m in p riorto asp irin treatment.Modeling for 4 h,gastric tissue was to harvest formeasuring the ac tivity of SOD and CAT,the contentofMDA,Bc l-2 and Bax,HE staining and PAS staining were performed.Results In modelg roup,the activity of SOD,CAT were significantly reduced while the content of MDA was significantly increased.The activity of SOD,CAT were increased while the contentofMDA was reduced in bacteria g roup(P＜0.01),there was no significantd ifference between bacteria and omep razole g roup.The Bc l-2 exp ression increased and Bax exp ression reduced in bacteria g roup.PAS stainning showed that themucus secretion was increased in bacteria g roup and HE staining showed that themucosa injury was attenuated in bacteria gorup.Conclusion C.butyricum can effectively p rotect the gastricmucosa againstdamages caused by asp irin inm ice.

Clostrid ium butyricum Aspirin Gastric ulcer Oxidative stress

2014-12-18）

（本文编辑：沈昱平）

温州市科技局项目（Y20130215，Y20110136）；浙江省新苗计划项目（2014R 413032）

325000温州市中西医结合医院肿瘤科（沈淑蓉）；温州医科大学检验医学院、生命科学学院（朱静、张浩、曾静静、付瑶阳、王雅琪）；温州医科大学基础医学院病生教研室，温州市中山医院内科（王方岩）

王方岩，E-mail：w zyxyw fy@126.com