口服精胺激发血浆皮质醇促进哺乳仔猪肠道发育的机理

2015-01-17程志斌白华毅苏子峰廖国周毕保良潘洪彬黄丽梅樊月圆

饲料工业 2015年24期

■程志斌白华毅苏子峰廖国周，4 毕保良赵平潘洪彬黄丽梅汪霞樊月圆

（1.云南农业大学，云南昆明 650201；2.云南省动物营养与饲料科学重点实验室,云南昆明 650201；3.大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003；4.云南省畜产品加工工程技术研究中心，云南昆明 650201）

我们前期的试验（程志斌等，2014；姜自琴等，2014）及他人（Sabater-Molina等，2009；何余湧等，2012；赵宏涛等，2015）的多个试验证明，口服精胺具有促进幼龄仔猪肠道发育及生产性能的作用。然而，精胺促进仔猪肠道发育的机制尚不明确，这影响了精胺在养猪实际生产中的应用推广。大量试验研究与综述显示：幼龄仔猪肠道的发育及肠黏膜二糖酶的比活力受到激素和多种生物活性分子的调控（Henning，1981；Arsenault等，1984；Chapple等，1989；Morisset，1992；Xu等，2000；赵宏涛等，2015）。就激素而言，血浆皮质醇显著影响幼龄动物肠道发育及肠黏膜二糖酶活性（Henning，1981；Morisset，1992；赵宏涛等，2015）。过去的试验数据证明：血浆皮质醇浓度与幼龄动物小肠黏膜麦芽糖酶和蔗糖酶比活力呈显著正相关（Arsenault等，1984；Chapple等，1989）；幼龄仔猪肌肉注射皮质醇，可以显著提高小肠黏膜麦芽糖和蔗糖酶比活力（Martin等，1982；Chapple等，1989）；相反，幼龄仔猪肌肉注射皮质醇激素抑制剂（例如：metyrapone，甲双吡丙酮）可以明显抑制小肠发育期的黏膜麦芽糖和蔗糖酶比活力，进而抑制肠道组织发育（Wu等，2000）。这些试验提示，口服外源精胺是否具有激发血浆皮质醇发挥促进哺乳仔猪肠道发育的作用机理，有待试验验证。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组

试验选取6头“长白×大白”妊娠母猪所产的6窝哺乳仔猪进行试验。仔猪出生后6 h，每头母猪窝仔数统一为10头。0日龄定义为第一头仔猪出生日，仔猪0～10日龄维持正常的哺乳。哺乳第11日龄的早晨07∶00～07∶30，每窝选取4头共24头体重最相近、健康状况良好的仔猪[初始体重(3.58±0.05)kg]进行试验。

试验处理组设计见表1，具体如下：试验采用随机区组设计，以窝别为区组，同窝的每头仔猪为试验重复和单元，将同窝选取的4头试验仔猪随机分配到4个处理组中的一个。4个处理组分别为：处理组1，口服生理盐水和注射生理盐水；处理组2，口服0.4 mmol/(kg BW·d)精胺和注射生理盐水；处理组3，口服生理盐水和肌肉注射5 mg/(kg BW·d)甲双吡丙酮；处理组4，注射5 mg/(kg BW·d)甲双吡丙酮和口服0.4 mmol/(kg BW·d)精胺。根据我们前期试验结果（程志斌等，2014；姜自琴等，2014），试验选取口服0.4 mmol/（kg BW·d）精胺。

表1 试验设计

1.2 精胺与甲双吡丙酮

精胺为Sigma公司产品，口服精胺溶液由0.9%生理盐水配制成浓度50 μmol/ml。甲双吡丙酮用生理盐水配制成浓度10 mg/ml。

1.3 饲粮组成

母猪的哺乳日粮按NRC（1998）营养推荐量配制玉米-豆粕型粉料，日粮组成和营养水平见表2。

表2 试验基础日粮配方及营养水平

1.4 饲养管理

哺乳母猪采用单栏饲喂管理，栏圈面积1.5×2.1 m2，乳头式饮水器自由饮水，哺乳日粮不限饲，饲喂时间为每日08∶00和17∶00。产仔舍的温度控制在(22±2)℃，仔猪保温箱通过加热灯维持温度(32±2)℃，产仔舍保持24 h光照。专门饲养员管理母猪采食情况，母猪采食后，剩余在料槽和抛洒在地面的饲料立即清扫干净，以防止仔猪采食。同时，哺乳全期所有仔猪不提供补料。在3 d的试验期中，试验仔猪和母猪健康状况良好。

1.5 试验过程与取样

参考Wu等（2000）的试验报道，按照表1试验设计，本试验建立仔猪血浆皮质醇抑制模型的试验过程具体如下：在11～13 d的早晨07∶00，所有试验仔猪按照处理组不同，分别注射生理盐水或甲双吡丙酮，口服生理盐水或精胺溶液，每天一次，持续3 d。血浆皮质醇抑制剂（甲双吡丙酮）的注射剂量是5 mg/(kg BW·d)。

13 d早晨07∶00，24头试验仔猪试验操作结束后2 h，所有试验仔猪颈静脉放血致死，采集血样分析血浆皮质醇浓度。

所有处理组空肠从小肠中点约50%处采样，取空肠20 cm黏膜，用于分析麦芽糖酶和乳糖酶比活力。同时，采集2 cm空肠，用10%甲醛溶液固定，用于分析绒毛高度和隐窝深度。

1.6 检测方法

所有分析检测在云南省动物营养与饲料重点实验室完成。血浆皮质醇使用放免法测定。二糖酶比活力测定参考我们前期报道的方法（姜自琴等，2014）。肠道绒毛高度和隐窝深度的测定参考李旋亮等（2014）和郭小云等（2015）的方法。

1.7 统计分析

试验数据用单因素方差分析和Student-Newman-Keuls多重比较，统计显著性用P＜0.05表示。统计软件使用SPSS 11.0。

2 结果与分析

2.1 血浆皮质醇浓度（见图1）

处理组1～4哺乳仔猪血浆皮质醇浓度分别为20.5、25.8、5.1、12.1 μg/l。注射甲双吡丙酮的处理组3和处理组4仔猪血浆皮质醇浓度低于处理组1（P＜0.05）；处理组2口服精胺仔猪血浆皮质醇浓度高于处理组1（P＜0.05）；处理组4血浆皮质醇浓度高于处理组3（P＜0.05）。

2.2 空肠黏膜二糖酶比活力（见图2和图3）

处理组1～4哺乳仔猪空肠黏膜麦芽糖酶比活力分别为118.5、195.3、88.3、144.2 U/g（肠黏膜蛋白）。处理组2仔猪空肠黏膜麦芽糖酶比活力显著高于处理组1、处理组4和处理组3（P＜0.05）；处理组1和处理组4麦芽糖酶比活力差异不显著（P＞0.05），但显著高于处理组3（P＜0.05）。

图1 肌肉注射甲双吡丙酮和口服精胺对哺乳仔猪血浆皮质醇浓度的影响

图2 肌肉注射甲双吡丙酮和口服精胺对哺乳仔猪空肠麦芽糖酶比活力的影响

图3 肌肉注射甲双吡丙酮和口服精胺对哺乳仔猪空肠乳糖酶比活力的影响

处理组1～4哺乳仔猪空肠黏膜乳糖酶比活力分别为143.7、95.8、153.2、115.2 U/g（肠黏膜蛋白）。处理组1和处理组3仔猪空肠黏膜乳糖酶比活力差异不显著（P＞0.05），显著高于处理组2和处理组4（P＜0.05），处理组2和处理组4之间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 空肠绒毛高度和隐窝深度（见图4和图5）

图4 肌肉注射甲双吡丙酮和口服精胺对哺乳仔猪空肠绒毛高度的影响

图5 肌肉注射甲双吡丙酮和口服精胺对哺乳仔猪空肠隐窝深度的影响

处理组1～4哺乳仔猪空肠绒毛高度分别为780.5、624.2、761.7、647.5 μm。处理组1和处理组3绒毛高度差异不显著（P＞0.05），显著高于处理组2和处理组4（P＜0.05），处理组2和处理组4绒毛高度差异不显著（P＞0.05）。

处理组1～4哺乳仔猪空肠隐窝深度分别为148.3、174.3、140.8、167.5 μm。处理组2和处理组4隐窝深度差异不显著（P＞0.05），但显著大于处理组1和处理组3（P＜0.05），处理组1和处理组3隐窝深度差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

精胺存在于所有真核细胞和原核细胞中，在哺乳动物细胞的增殖、增生和分化等生物过程中有重要的生理作用，尤其是对幼龄哺乳动物的小肠黏膜上皮细胞等快速增殖和分化的组织细胞（Sabater-Molina等，2009；程志斌等，2014；姜自琴等，2014）。近年来，已有大量试验证明（Sabater-Molina等，2009；何余湧等，2012；程志斌等，2014；姜自琴等，2014；赵宏涛等，2015）：口服精胺具有促进幼龄仔猪肠道发育的作用，在养猪生产实际中有应用的潜能。由于精胺促进幼龄仔猪肠道发育的机制尚不明确，本试验设计皮质醇抑制模型，初步探索精胺促进哺乳仔猪肠道发育和成熟的机理。

3.1 皮质醇抑制模型的建立

图1血浆皮质醇浓度结果显示：注射甲双吡丙酮的处理组3和处理组4仔猪血浆皮质醇浓度显著低于处理组1（P＜0.05），本试验模型与Wu等（2000）结果一致。说明本试验成功的建立了皮质醇抑制模型，此模型适合用于本次试验研究口服精胺促进哺乳仔猪肠道发育的机制。

处理组2仔猪血浆皮质醇浓度显著高于处理组1（P＜0.05），说明口服外源精胺激发了仔猪血浆皮质醇分泌，这一结果与赵宏涛等（2015）在日粮添加精胺促进哺乳仔猪血浆皮质醇浓度提高的结果一致。此外，Kaouass等（1994）用大鼠试验也发现，口服精胺提高了哺乳大鼠的血浆皮质醇浓度。以上结果提示，精胺可能通过激发皮质醇间接促进哺乳仔猪小肠的发育。

进一步分析显示（见图1）：同时注射甲双吡丙酮和口服精胺的仔猪（处理组4）血浆皮质醇浓度，比处理组3未口服精胺且注射甲双吡丙酮的仔猪血浆皮质醇浓度高（P＜0.05），但仍然低于处理组1（P＜0.05）。这一结果证明，在抑制皮质醇模型下，口服精胺虽然显著提高了仔猪血浆皮质醇浓度，但血浆皮质醇浓度不能恢复到正常哺乳仔猪的水平。

综合以上皮质醇抑制模型的试验数据证明，口服外源精胺有激发哺乳仔猪合成和分泌皮质醇的作用。在此模型基础上，我们进一步分析标志小肠发育的黏膜二糖酶活性和肠道形态。

3.2 口服精胺激发皮质醇对哺乳仔猪肠道黏膜二糖酶的影响

小肠黏膜二糖酶比活力是幼龄仔猪肠道发育的重要指标之一，可以作为肠道发育的标识（Henning，1981；Chapple等，1989；Xu等，2000；Mateo等，2014；乔家运等，2014；汪珊如等，2015）。血浆皮质醇对仔猪肠道发育的影响体现在小肠黏膜麦芽糖酶和蔗糖酶活性的调控作用（Arsenault等，1984；Morisset，1992；Xu等，2000；赵宏涛等，2015）。一般而言，随着哺乳仔猪日龄增加，血浆皮质醇浓度升高，并显著提高小肠黏膜麦芽糖活性，降低小肠黏膜乳糖酶活性（Chapple等，1989；Xu等，2000；姜自琴等，2014；赵宏涛等，2015）。

图2显示：处理组3注射皮质醇抑制剂甲双吡丙酮的仔猪空肠黏膜麦芽糖酶比活力显著低于处理组1（P＜0.05），说明血浆皮质醇的浓度降低抑制了哺乳仔猪空肠黏膜麦芽糖酶活性的增加，这与Chapple等（1989）和Wu等（2000）的结果一致。由此可见，血液皮质醇的正常生理浓度对幼龄哺乳动物小肠的正常发育至关重要（Arsenault等，1984；Chapple等，1989；Xu等，2000；Wu等，2000）。另一方面也证明：本试验建立的皮质醇抑制模型适合用来研究精胺激发皮质醇间接促进肠道发育的作用机理。

处理组4仔猪同时口服精胺和注射甲双吡丙酮，空肠黏膜麦芽糖酶比活力显著高于处理组3（P＜0.05），与处理组1相比差异不显著。这一结果说明，在抑制血浆皮质醇模型下，口服精胺使皮质醇抑制仔猪的空肠黏膜麦芽糖酶比活力恢复到正常哺乳仔猪水平。这证明精胺作用空肠上皮细胞，提高麦芽糖酶比活力的直接作用机制。然而，处理组4空肠黏膜麦芽糖酶比活力与处理组3相比虽然显著提高，但仍然未达到处理组2口服精胺仔猪的空肠黏膜麦芽糖酶比活力水平。同样口服精胺，处理组4与处理组2相比，空肠黏膜麦芽糖酶比活力的降低显然是因为在血浆皮质醇抑制条件下，较低的血浆皮质醇浓度使口服精胺不能完全逆转低水平血浆皮质醇导致的麦芽糖酶比活力降低。由此可见，从以上黏膜麦芽糖酶比活力数据指标说明，精胺对小肠发育和成熟的促进效果是通过激发血浆皮质醇实现的。

此外，图3显示：在抑制血浆皮质醇条件下，处理组1（正常皮质醇浓度）和处理组3（抑制皮质醇浓度）空肠乳糖酶比活力差异不显著。这一结果说明，血浆皮质醇对乳糖酶无调控作用。这与Martin等（1982）用大鼠试验、Chapple等（1989）用仔猪试验，发现血浆皮质醇浓度不影响乳糖酶比活力的结论一致。Henning（1981）和Morisset（1992）综述显示：无论是猪还是大鼠，黏膜乳糖酶酶蛋白合成和乳糖酶比活力表达的调控机制与麦芽糖酶不同，血浆皮质醇只能影响麦芽糖酶比活力，对黏膜乳糖酶比活力没有显著影响。

3.3 口服精胺激发皮质醇对哺乳仔猪肠绒毛高度和隐窝深度的影响

在抑制血浆皮质醇条件下，处理组1和处理组3空肠绒毛高度差异不显著，说明血浆皮质醇对肠形态学无显著影响（图4）。无论是否注射甲双吡丙酮，两组口服精胺的仔猪（处理组2和处理组4）空肠绒毛高度与处理组1未口服精胺的仔猪相比均显著降低（P＜0.05），这充分说明口服精胺的直接作用是降低了空肠绒毛高度。图5肠隐窝深度的测定结果也显示了相似结果，无论是否注射甲双吡丙酮，两组口服精胺的仔猪（处理组2和处理组4）空肠隐窝深度与处理组1未口服精胺的仔猪相比，均显著提高（P＜0.05）。因此，综合以上结果：空肠形态学绒毛高度和隐窝深度的试验结果均说明，口服精胺虽激发皮质醇分泌，但无通过皮质醇分泌影响肠道形态学的作用效果。

肠绒毛高度和隐窝深度这两个形态学指标是反映小肠上皮细胞发育与功能状况的重要标志（Hampson，1986；Morisset，1992；Xu等，2000；程志斌等，2014；李旋亮等，2014；乔家运等，2014）。绒毛高度降低说明肠上皮细胞更新和衰亡的平衡打破，可能的原因包括两个方面：其一，肠上皮细胞在外因作用下更新的速度降低，这体现在隐窝深度降低或者不变，隐窝干细胞的分裂和分化速度降低。典型的例子是禁食或者采食量降低引起的肠绒毛高度降低（Morisset，1992；Xu等，2000；程志斌等，2014）；其二，上皮细胞在外因诱导下加快了凋亡速度，隐窝深度提高，隐窝干细胞加速分裂和分化，以弥补肠绒毛上皮细胞的损失，尽量恢复绒毛高度，使动物尽快适应肠道逆境。典型的例子包括各类抗营养因子致使的仔猪绒毛高度降低和隐窝深度提高（Hampson，1986；乔家运等，2014；郭小云等，2015）。显然，本次试验口服精胺引起的肠绒毛高度降低和隐窝深度提高，属于第二种情况，说明幼龄哺乳仔猪口服精胺使肠绒毛成熟的形态学变化从断奶阶段提前至哺乳阶段，提前发育成熟的肠道有利于仔猪应付断奶后的综合应激。这一结果符合仔猪实际养殖生产的需求，尤其是早期断奶技术在生产中的应用。此外，这一结果也提示：口服的精胺没有通过皮质醇分泌影响肠道形态学，更有可能是精胺直接作用于肠黏膜上皮细胞的效应。当然，这一推测有待于进一步的试验验证。