慢性咽炎合剂的质量标准研究

2015-01-17侯惠婵

长春中医药大学学报 2015年1期

张韵，吴晖，侯惠婵

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广州510641;2.广州市黄埔区食品药品检验所，广州510700;3.广州市药品检验所，广州510160)

慢性咽炎合剂是广州市黄埔区中医院制剂，在临床使用多年。方由咸竹峰、连翘、木蝴蝶、板蓝根、岗梅根、荆芥、柴胡、白花蛇舌草、桔梗、甘草等组成，具有疏风驱邪，解毒利咽之功，治疗慢性咽炎疗效满意。方中君药连翘的有效成分为连翘苷，药理研究［1］表明，连翘苷具有抗菌、抗病毒、强心、抑制毛细血管通透性的作用，《中国药典》［2］将其作为连翘的质量控制指标之一，本实验采用连翘苷作为该制剂的含量测定指标。为保证各批次产品质量的稳定性，确保疗效，建立了慢性咽炎合剂的质量控制指标，方法可行，操作简便，重现性好。

1 仪器与试药

慢性咽炎合剂(批号 130614，130620，130925，131010，131011)由广州市黄埔区中医医院提供，乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，磷酸(色谱纯)，冰醋酸(色谱纯)，中性氧化铝(100-200目，分析纯)，薄层预制板(批号20130806，青岛海洋化工厂)，展开剂所用试剂均为分析纯。连翘苷对照品(110821-200711)，连翘对照药材1 g(120908-200512)，白花蛇舌草对照药材 1 g(121183-200402)，柴胡皂苷 a对照品(110777-200507)，柴胡对照药材 1 g(120992-200504)，荆芥对照药材1 g(0911-9806)，均由中国药品生物制品检定所提供。高效液相色谱仪:Waters 2695泵，检测器UV-Waters 2996，百万分之一电子分析天平(梅特勒XP26)。

2 方法与结果

2.1 连翘薄层色谱鉴别取本品20 mL，水浴蒸干，加中性氧化铝1 g拌匀后加置中性氧化铝柱(100～200目，2 g，内径1.5 cm)上，用70%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至1 mL，作为供试品溶液;取连翘苷对照品，用乙醇配成0.5 mg/mL溶液，作为对照品溶液;取连翘对照药材1 g，乙醇20 mL加热回流30 min，滤液蒸干，与供试品溶液同法操作，作为对照药材溶液;取缺连翘阴性制剂20 mL，与供试品同法操作，作为阴性对照溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇(8∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，分别置日光和紫外灯365 nm下检测，结果见图1。

2.2 白花蛇舌草薄层色谱鉴别取本品20 mL，蒸干，残渣加甲醇10 mL溶解，过滤，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液;取白花蛇舌草对照药材1 g，加水煎煮(50，30 mL)每次1 h，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，滤过，作为对照药材溶液;取缺白花蛇舌草的阴性制剂20 mL，与供试品同法操作，作为阴性对照溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以正丁醇-浓氨-乙醇(5∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰，结果见图2。

图1 连翘药材鉴别的薄层色谱图

2.3 柴胡薄层色谱鉴别取本品50 mL，用水饱和正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，用5%Na2HCO3溶液洗涤1次，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液;取柴胡皂苷a对照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液;取柴胡对照药材1 g，加甲醇30 mL，加热回流1 h滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，与供试品溶液同法操作，作为对照药材溶液;取缺柴胡的阴性制剂50 mL，与供试品同法操作，作为阴性对照溶液。吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加热至斑点清晰，分别至日光和紫外光(365 nm)下检视，结果见图3。

2.4 荆芥薄层色谱鉴别取本品50 mL，加石油醚Ⅱ(60～90℃)提取2次，每次20 mL，合并石油醚Ⅱ提取液，浓缩至1 mL，作为供试品溶液;取荆芥对照药材1 g，加石油醚(60～90℃)20 mL，密塞，振摇20 min，放置过夜，滤过，滤液挥至1 mL，作为对照药材溶液;取缺荆芥的阴性制剂50 mL，与供试品溶液同法制成，作为阴性对照溶液。吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(8.5∶1.5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛的5%硫酸乙醇溶液，在105℃下加热至斑点清晰，结果见图4。

图2 白花蛇舌草特征鉴别的薄层色谱图

图3 柴胡特征鉴别的薄层色谱图

2.5 连翘苷含量测定

2.5.1 色谱条件及系统适应性色谱柱:Kromasil C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相:乙腈-0.1%磷酸(25∶75);检测波长:277 nm［2］;柱温:30 ℃;流速:1.0 mL/min;理论塔板数:按连翘苷峰计算应不低于3 500。

2.5.2 溶液制备精密称取连翘苷对照品2 mg，至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得0.20 mg/mL的对照品溶液;精密量取样品1 mL，加中性氧化铝0.5 g拌匀，加置中性氧化铝柱(100-200目，2 g，内径1～1.5 cm)上，用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，滤液作为供试品溶液;取缺连翘的阴性溶液1 mL，同法操作，作为阴性对照溶液。

2.5.3 专属性试验取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各10 μL，进行色谱测定，结果样品和对照品在同一保留时间有相同的波峰出现。而阴性对照溶液则无相应的峰，证明阴性对照不干扰测定，可作为含量测定专属。

2.5.4 线性关系考察在上述色谱条件下，分别进样1，2，5，10，20 μL 进行测定，以进样量 X(μL)分别对应峰面积 Y进行线性回归，得回归方程 Y=145 909 X－18 848(r=0.999 8)。结果表明:连翘苷进样量在0.2～4 μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.5.5 检测限、定量限取2.1项下对照品溶液，用甲醇逐级稀释后检测，当信噪比S/N≈3时计算检测限，信噪比S/N≈10时计算定量限，在该色谱条件下，连翘苷检测限7.2 ng，定量限18.6 ng。

图4 荆芥鉴别的薄层色谱图

2.5.6 精密度试验、重复性试验、稳定性试验吸取对照品溶液与供试品溶液，各进样5次。连翘苷对照品5次测定的峰面积平均值为1 392 899，RSD为0.45%;供试品中连翘苷的平均值为1 476 288，RSD为0.95%;说明仪器精密度良好，方法重复性好。取同一批供试品溶液(批号为131011)，制备后室温(25 ℃)放置，分别于0，1，2，4，8，16，24，48 h 进样测定，结果连翘苷峰面积的RSD为1.25%，表明慢性咽炎合剂供试品溶液在48 h内比较稳定。

2.5.7 加样回收率试验精密量取0.5 mL，已知连翘苷含量的慢性咽炎合剂(批号为131011)9分，分别精密加入0.2 mg/mL连翘苷对照品溶液相当于慢性咽炎合剂中连翘苷含量的80%，100%，120%，每个浓度平行做3分，进行测定，计算加样回收率，见表1。

2.5.8 样品含量测定取5批不同批号的慢性咽炎合剂制剂，每批2分，每分平行测定2次，取平均值，计算样品中连翘苷的含量，结果130 614，130 620，130 925，131 010，131 011 的含量测定结果为 0.582，1.401，1.204，0.770，1.133。

3 讨论

连翘薄层色谱中用5%香草醛硫酸作为显色也能达到显色效果，但是显色后斑点容易扩散，比较两种显色剂，最终选用10%硫酸乙醇［3］。

白花蛇舌草的药用成分为极性较大的黄酮类、蒽醌类、萜类、甾醇类［4］，因此选择极性大的正丁醇作为展开剂，加入浓氨可以改善斑点，减少拖尾。

板蓝根也是该制剂中一个用量比较大的药味，RS-告依春是代表性有效成分之一，是反应板蓝根药材质量的重要指标［5］，但是找不到合适的分离方法和专属的显色剂，所以最终放弃了板蓝根的鉴别项。

表1 连翘苷的加样回收率实验结果

本实验还进行了柴胡薄层色谱鉴别和荆芥薄层色谱鉴别，结果:柴胡鉴别项尝试了乙酸乙酯-甲酸-水(20∶3∶1)和乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)展开系统［6］，发现后一个分离效果更好，无论日光还是紫外光下都斑点清晰。荆芥的化学成分主要是挥发油类、萜类、黄酮类、酚酸类［7］，用石油醚Ⅱ提纯后，获得满意的分离效果。

连翘苷在碱性环境下(pH 9.4)极其不稳定，中性条件下60℃左右时较为稳定，在酸性环境下(pH 4.03)稳定［8］，故在流动相中加入少量磷酸，以乙腈－0.1%磷酸(25∶75)作为流动相，连翘苷的出峰时间在8 min左右，且峰形好，分离度高，因此本实验采用此体系为流动相。

经过对氧化铝用量、洗脱试剂及其用量进行考察发现，氧化铝用量1，2 g结果相似，但1 g杂质峰较多，3，4 g氧化铝对连翘苷含量有一定影响，故选用2 g氧化铝;分别用70%甲醇和70%乙醇进行洗脱，结果基本相同，但甲醇毒性较乙醇大，因此选用70%乙醇作为洗脱溶剂。

白花蛇舌草也是本制剂方中君药，广东省中药标准中［9］把熊果酸、齐墩果酸含量作为白花蛇舌草的质量控制指标，本制剂中也能检测到熊果酸和齐墩果酸，但是由于连翘、荆芥、岗梅根中都含有熊果酸和齐墩果酸成分［10-11］，因此测定熊果酸和齐墩果酸含量对于药味的用量控制意义不大。

医院制剂要走现代化生产之路，发展自己的特色制剂，走出困境实现可持续发展，医院制剂的发展也将有力促进医院药学学科的整体发展，提高医院的医疗水平，同时也从另一方面提升医院的知名度和影响力，创造良好的社会效益和经济效益［12］。

［1］夏晖，刘峰群，周艳萍，等.HPLC法同时测定连翘中连翘苷和连翘酯苷 A的含量［J］.解放军药学学报，2014，30(1):60-62.

［2］中华人民共和国药典委员会.中国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［3］张贞丽，韩莉，袁敏，等.连翘薄层鉴别方法研究［J］.中药材，2007，30(1):31-32.

［4］张创峰，杨友亮，刘普，等.白花蛇舌草化学成分和药理作用研究进展［J］.西北药学杂志，2012，27(4):379-382.

［5］安益强，贾晓斌，陈彦，等.HPLC法测定不同产地板蓝根中表告依春［J］.中草药，2008，39(11):1739-1741.

［6］谭杰，李月平，秦德松.薄层色谱法用于补中益气丸中柴胡定性鉴别的研究［J］.科技视界，2013(16):174.

［7］赵立子，魏建和.中药荆芥最新研究进展［J］.中国农学通报，2013，29(4):39-43.

［8］罗集鹏.生药学［M］.北京:中国医药科技出版社，1995:271-271.