Box-Behnken实验设计法优化花生衣中总黄酮提取工艺

2015-01-17朱丽红柳小莉唐志书郭东艳

长春中医药大学学报 2015年1期

白甫，朱丽红，柳小莉，唐志书，郭东艳

(陕西中医学院药学院，陕西咸阳712046)

花生衣为豆科植物落花生(Arachis hypogaea L.)的种皮，味甘、微苦、性平，具有健脾和胃、养血止血、散瘀消肿之功。文献报道［1］其主要含有脂质、鞣质、甾醇、花生苷、花生衣色素、儿茶素等成分，其中主要色素成分为黄酮类化合物。文献报道［2-3］花生衣具有止血作用、抗纤维蛋白溶解、促进骨髓制造血小板、缩短出血时间、加强毛细血管的收缩、调整凝血因子缺陷等功能。临床试验观察结果［4-6］表明，花生衣汤能提高化疗周期患者的血红蛋白、提高肝硬化患者的血小板数及具有防止化疗引起血小板降低的作用。近年来广泛用于胃肠、肺、子宫等内脏出血及放化疗引起的血小板减少症等。但鲜有花生衣提取工艺研究的文献报道［7-8］。本文拟采用Box-Behnken实验设计法优化花生衣中总黄酮的提取工艺，以期为今后进一步开发利用奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料花生衣购于西安盛兴中药饮片有限责任公司，经陕西中医学院王继涛老师鉴定为豆科植物落花生(Arachis hypogaea L.)的种皮;芦丁对照品(中国生物制品检定所，批号100080-200707)，儿茶素对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号:110877-201102);甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher公司);其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2695泵，Waters 2996二极管阵列检测器;UV-1102型紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);WJN-50多功能真空浓缩机(韩国);梅特勒GB204电子天平(万分之一);KH-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);D101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定［9］

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒重的芦丁对照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，加20 mL甲醇，超声处理溶解，再用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备精密移取样品液1 mL，用50%甲醇定容至50 mL量瓶中。精密吸取0.5～25 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 总黄酮最大吸收波长的确定分别对对照品溶液和供试品溶液在200～800 nm范围内进行扫描，结果均在510 nm处有强吸收峰。

2.1.4 标准曲线的制备精密量取对照品溶液2，3，4，5，6，7 mL，分别置 25 mL 量瓶中，各加水至 6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》附录ⅤA)，在510 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程A=11.339X－0.035，r2=0.999 7，结果表明芦丁在0.016～0.056 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5 样品中总黄酮含量测定精密吸取供试品溶液1 mL，加水至6.0 mL，按2.1.4项下“加50%亚硝酸钠溶液1 mL”起，至“在510 nm波长处测定吸光度”，记录吸光度，计算总黄酮含量。

2.2 儿茶素含量测定［10］

2.2.1 儿茶素对照品溶液的制备精密称取儿茶素对照品10 mg，置于50 mL量瓶中，加入50%的甲醇溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备精密吸取花生衣样品液1 mL，用50%甲醇定容至50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。摇匀，即得。

2.2.3 色谱条件色谱柱:Thermo BDS Hypersil C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水(10∶90);检测波长:280 nm;流速:1 mL/min;柱温30℃。

2.2.4 含量测定精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，计算儿茶素的含量。

2.3 Box-Behnken实验设计法优选总黄酮提取工艺

2.3.1 评价指标的确定总黄酮作为花生衣的主要成分，是其发挥药效的物质基础，原花青素是花生衣总黄酮的主要组成部分，而原花青素主要有儿茶素和表儿茶素的单体或多聚体组合而成，儿茶素具有防治心血管疾病、预防癌症等多种功能。它为还原性多元酚类物质，在水溶液中易被空气氧化，常用作抗氧化剂。右旋儿茶素还有降低毛细血管的通透性、止泻、止血、抗病毒、杀真菌、及预防胃溃疡等多种作用，所以将儿茶素的含量定为另一评价指标。根据各指标成分在工艺选择中的主次地位，给予不同的加权系数，求出综合评价指标 Y［11］。

2.3.2 各因素水平的确定采用软件Design-Expert 8.0.5中的Box-Behnken试验设计原理，根据预实验结果，选取乙醇浓度、液料比与提取时间3个因素，分别以A，B，C表示，每个自变量的低中高水平分别以－1，0，1进行编码，总黄酮与儿茶素含量为响应值，设计三因素三水平共17个试验点的响应面分析试验。因素水平分析选取见表1。

表1 花生衣总黄酮提取工艺响应面因素水平编码

2.3.3 Box-Behnken试验设计方案设计方案与试验结果见表2～表3。

表2 Box-Behnken设计方案与试验结果

表3 二次回归方程方差分析

2.3.4 模型的建立及显著性检验用软件分析响应面的回归参数，建立各影响因素之间的数学模型，以综合评分为响应值的方差分析可知，一次项 A＜0.01，各因素对响应值Y的线性关系显著;二次项A2、B2对响应值(综合评分)Y的曲面效应显著。利用Design-Expert 8.0.5软件对表3数据进行多元回归拟合，得到响应值Y对乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取时间(C)的二次多项回归模型:Y=19.03+0.49×A+0.22×B－0.037×C－0.16×A×B+0.25×A×C－0.026×B×C－1.53×A2－0.70×B2－0.03×C2，方差分析结果见表4。根据数理统计学的相关知识分析，由表3可知，整体数学模型达到显著水平(P＜0.01)，表明在试验因子与响应值确定的回归方程中，其应变量与各个自变量之间的线性关系极显著，说明该二次方程模型比较显著。模型的失拟项不显著(P＞0.05)，该方程对试验拟合较好，可以对不同条件下的总黄酮含量进行预测。此外，该模型的变异系数(CV)为1.97%，在可接受范围内。数学模型的相关系数r2=0.943 2。综合分析表明用此模型来分析和预测花生衣中总黄酮的提取工艺结果是比较合适的。在回归方程模型中，对各因变量进行的方差分析结果表明:模型一次项A差异极显著;交互项差异不显著;各个二次项A2、B2差异极显著，说明不能用简单的线性关系来描述试验因素与响应值之间的关系。从回归方程的系数值和方差分析结果可以看出，在响应面的试验范围内，各个试验因素的主效应关系为:乙醇浓度＞料液比＞提取时间。各个试验因素对花生衣总黄酮得率影响的响应曲面及等高线见图1～图3。