三黄泻心汤水提物对痤疮丙酸杆菌体外抑制实验

陈芳园，闵仲生

(1.南京中医药大学，南京210029;2.江苏省中医院，南京210029)

痤疮是一种临床常见好发于毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，各年龄皆可发病，青少年时期发病率最高。近年来由于饮食结构及环境等改变，发病率有上升趋势，由于病程较长，严重者可发展成结节、囊肿以及聚合性痤疮，愈后容易留下痘印凹坑，严重影响美观，造成患者的心理压力。三黄泻心汤出自张仲景《金匮要略》［1］“大黄2两，黄连1两，黄芩1两，以水3升，煮取1升，顿服之”。方中大黄为主药，黄连、黄芩为辅药。本实验采用不同浓度三黄泻心汤水提物，观察在体外对痤疮丙酸杆菌生长的抑制情况。报告如下。

1 材料

1.1 菌株 痤疮丙酸杆菌冻干菌株标准菌株(ATCC11827，购自广东省微生物研究所)。

1.2 试药 注射用乳糖酸红霉素粉针(购自湖南科伦制药有限公司，批号:1310202B);三黄泻心汤(由江苏省中医院药剂科配置提供)。厌氧指示剂、厌氧产气袋(选自日本三菱瓦斯株式会社);琼脂(L3027，购自美国Sigma-Aldrich公司)。

1.3 仪器 恒温生化培养箱(选自上海跃进医疗器械有限公司);数显气浴恒温振荡器(常州赛普实验仪器厂);立式压力蒸汽灭菌器(选自博讯实业有限公司医疗设备厂);WGZ-1A浊度计(上海昕瑞仪表有限公司);BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器［北京］有限公司);7.0 L厌氧盒(三菱瓦斯化学株式会社)。

2 方法与结果

2.1 痤疮丙酸杆菌的复苏以及菌悬液的制备 琼脂培养基115℃高压灭菌15 min浇板，作为冻干菌株复苏平板。微生物限度室内，将全部菌体悬液，移植于琼脂培养基，平推后置于厌氧培养盒内，37℃厌氧培养48 h，挑取单个生长菌落至肉汤培养基。

2.2 菌落计数 提取已经配备好的菌悬液1 mL，加到9 mL装有生理盐水的试管中，就可以得到稀释10倍的菌液。从稀释10倍的菌悬液中移取1 mL至9 mL生理盐水中，从而得到稀释100倍的菌液。以此类推，依次稀释，直至得到稀释1 010倍的菌液，从中各移取0.5，1 mL到平板培养基上，均匀涂布，37℃厌氧培养48 h，然后对生长的菌落进行计数，作出细菌的生长标准曲线。调整细菌浓度至106，待用。

2.3 中药药液稀释 采用试管稀释法。三黄泻心汤煎剂调整至相当于生药浓度200 mg/mL，取11支灭菌试管加入营养肉汤1.0 mL，移取三黄泻心汤煎剂1 mL，加入第1管中，充分混和均匀后取1 mL，加入第2管，以此类推，到第10根试管时从中取1 mL弃去，最后一根试管中不加任何药物，只作为培养基对照组，稀释浓度和相应药物含量见表1。

表1 三黄泻心汤水提物药物稀释度和相应药物含量

2.4 罗红霉素药液稀释 采用试管稀释法。将乳糖酸红霉素调整浓度至200 mg/mL，取11支灭菌试管加入营养肉汤1.0 mL，将配备好的乳糖酸红霉素1 mL，加入到第1根试管中，充分混匀混合后取1 mL，再移入第2根试管，以此类推，第10根试管取1 mL弃去，最后一根试管为培养基对照组，稀释浓度和相应药物含量见表2。

2.5 药敏试验 用100 μL定量加样枪于每管中加入上述新鲜配置菌液100 μL，摇匀，加2～3 mL液体石蜡，置于37℃恒温振荡器中培养48 h，观察结果。

表2 乳糖酸红霉素药物稀释度和相应药物含量

2.6 结果判定 由于中药的颜色都较深，所以光是靠肉眼无法判定试管中是否有细菌生成以及对药物的敏感情况。因此在恒温振荡器培养48 h后，每管吸取0.5 mL混悬液接种，浇板，置于37℃恒温、厌氧环境中培养48 h，将平板放置在无反光，暗色的物体表面上观察各平板是否有菌落产生，这种方法可以排除中药颜色深带来的感染，可以直观的观察到实验结果。在实验过程中能够完全抑制痤疮皮肤杆菌的生长的药物浓度，为对细菌的最低抑菌药物浓度(MIC)，以上实验步骤重复3次。

2.7 结果 空白对照试管中观察有菌落生成，在革兰氏染色镜检下可见紫色细小棒状或杆状菌，证明是革兰氏阳性厌氧菌痤疮丙酸杆菌，未见其他菌在视野中，没有被污染［2］。三黄泻心汤水提和乳糖酸红霉素对痤疮丙酸杆菌的MIC，见表3。结果表明三黄泻心汤在浓度低至6.25 mg/mL时，平板可见痤疮丙酸杆菌菌落，高于此浓度时，均未见痤疮丙酸杆菌菌落，说明三黄泻心汤及其主要成分大黄、黄芩、黄连对痤疮的主要致病菌痤疮丙酸杆菌有较好的抑制作用，乳糖酸红霉素培养平板中均未见痤疮丙酸杆菌的菌落。

表3 三黄泻心汤和乳糖酸红霉素对痤疮丙酸杆菌的抑制作用

3 讨论

现代医学认为，痤疮的发病机制主要与皮脂分泌过多、毛周角化过度、痤疮丙酸杆菌繁殖以及炎症反应四种因素相关［3］，而毛囊皮脂腺中的痤疮丙酸杆菌大量繁殖是痤疮发病的重要因素［4］。有学者［5］认为痤疮的严重程度与皮脂腺的分泌量有关，皮脂分泌过多则痤疮丙酸杆菌的养料就越多。痤疮丙酸杆菌(P.acnes)［6］是定居在人体皮肤和黏膜中的正常菌群，属于小杆菌，它的生长是通过皮脂中的三酰甘油作为养料，并且皮脂中去脂化的脂肪酸含量与细菌的数量成正比。同时痤疮丙酸杆菌产生的大量胞外酶，痤疮丙酸杆菌介导的细胞免疫这些都增强了痤疮的炎症反应，是引发痤疮炎性反应的主要原因［7］。

一般在中重度的痤疮的治疗中，都会考虑结合抗生素的治疗，而最常用的抗生素有大环内酯类、四环素类或克林霉素等。红霉素是大环内酯类代表性抗生素，对痤疮丙酸杆菌有很强的抑制作用，但是Eady等［8］研究表明痤疮患者中痤疮丙酸杆菌耐药性的发生率在逐年上升，红霉素的耐药性最为多见，四环素耐药其次。有报道［9］认为丙酸杆菌对红霉素产生耐药是因为红霉素A、B、C基因保护这些新合成的核糖体免受大环内酯类药物的影响，并且红霉素还存在交叉耐药，导致药物疗效更差。

传统中医认为痤疮的发病是由肺热、血热、风热三要素所引起，而现代医家在原来的基础之上又提出了血瘀、湿热等新看法［10］。三黄泻心汤具有泻火解毒，燥湿泄热的作用，是治疗外科疮疡的常用方，泻火剂中的代表性方剂［11］。大黄、黄连、黄芩泄三焦之火，因此在临床应用中三焦实火或无形热邪内迫都可用三黄泻心汤治疗，所以有很多医家用于治疗痤疮。如乔成林［12］用本方加减治疗痤疮;国内研制［13］的纯中药制剂一清胶囊也是原方出自《金匮要略》中的泻心汤，一清胶囊中大黄、黄连、黄芩相互配伍，常用于治疗热毒血盛之身热烦躁，目赤口疮，咽喉、牙龈肿痛，大便秘结等症，具有凉血止血、清热泻火之功效［14］，还有报道［15］其临床应用广泛，除能有效治疗痤疮外，还用于咽喉炎、丹毒、高血压、上呼吸道感染等多种疾病。

大黄主要是含蒽醌类衍生物和二蒽酮衍生物［16］，具有显著抑制巨噬细胞分泌细胞因子的功能，大黄中的游离蒽醌对痤疮丙酸有很强的抑制作用，同时还对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌等多种细菌、真菌都有一定的抑制作用［17］;黄芩的主要化学成分是黄酮类，具有抗菌、消炎、抗氧化、神经系统保护等多种作用，具有广谱抗菌的活性［18］;黄连含有多种生物碱，最主要的是小檗碱(黄连素)，其次是黄连碱，药根碱等，抗菌谱广，对于多种致病菌都有很好的抑制作用(如金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、淋球菌及白色念珠菌等真菌)［19］。现代实验研究［20-21］发现，大黄、黄芩等中药在体外较低浓度时即能抑制痤疮丙酸杆菌的生长，表现出良好的抗菌效果。三黄泻心汤中3种主要成分是大黄酸、小檗碱、黄芩苷，为实验采用三黄泻心汤水提物进行痤疮丙酸杆菌体外抑菌实验提供了理论依据。

本实验以三黄泻心汤水提物为试药，乳糖酸红霉素标准品为参照物，对痤疮丙酸杆菌进行体外抑菌实验。实验结果三黄泻心汤水提物对痤疮丙酸杆菌的MIC是6.25 mg/mL，表明其对痤疮丙酸杆菌的生长有非常好的抑制作用。有研究［22］发现中药提取物对痤疮丙酸杆菌有明显抑制和杀菌作用，并且产生耐药性的可能性极低。三黄泻心汤作为单纯的中药复方制剂，对细菌不容易产生耐药性，并且毒副作用更小。此实验为三黄泻心汤的进一步在临床上的应用提供了科学的药效学理论依据。

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