蒸制时间对佛手主要成分与抗氧化活性的影响

黎 珊， 高 明， 陈 康*， 陈燕霞， 张林杰

（1.广州中医药大学中药学院，广东广州510006；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405）

［饮片炮制］

蒸制时间对佛手主要成分与抗氧化活性的影响

黎 珊1， 高 明1， 陈 康1*， 陈燕霞2， 张林杰1

（1.广州中医药大学中药学院，广东广州510006；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405）

目的研究不同蒸制时间对佛手总黄酮、橙皮苷及5，7-二甲氧基香豆素成分及其抗氧化活性的影响。方法采用紫外分光光度法测定佛手总黄酮含有量；HPLC法测定橙皮苷及5，7-二甲氧基香豆素含有量；DPPH法检测这些化合物的抗氧化活性。结果2.5 h蒸制时间对佛手总黄酮和橙皮苷的含有量均出现峰值，分别达到50.416 mg/g和1.038 mg/g，蒸制后5，7-二甲氧基香豆素含有量呈减少趋势，2.5 h蒸制下降最少，为1.628mg/g。蒸制2.5 h的佛手抗氧化能力最强。结论蒸制时间对制佛手主要成分及抗氧化均有显著影响，且总黄酮和橙皮苷的量与其抗氧化活性之间具有相关性。

佛手；蒸制；总黄酮；橙皮苷；5，7-二甲氧基香豆素；动态变化；抗氧化

佛手为芸香科植物佛手Citrusmedical L.var. sarcodactylis Swingle的干燥果实［1］，主产于广东高要、德庆等地，为十大广药之一。现代研究表明，佛手含有挥发油、柠檬油素、香叶木苷、橙皮醇、香豆素、黄酮等［2-5］20多种化学成分，具有止咳、化痰、平喘、健胃、止呕、抗炎、抗惊厥、抗癌等［6-13］药理作用。制佛手为岭南特色饮片，临床应用时以佛手蒸制后入药，以降低辛燥性，但目前对佛手蒸制过程中其主要成分的变化尚无相关研究，以致蒸制时间的确定无相应的理论依据支持。本实验对不同蒸制时间的制佛手主要成分动态变化以及抗氧化性进行研究，为佛手炮制机理及生产工艺提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪，2998 PDA检测器，Empower3色谱工作站（美国沃特世公司）；Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美国赛默飞世尔科技公司）；8453E紫外可见分光光度计（美国Agilent科技公司）。

1.2 对照品及试药 橙皮苷 （中国食品药品检定研究院，批号110721-201115）；5，7-二甲氧基香豆素 （中国药品生物制品检定所，批号 120711-201213）；无水乙醇 （分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇 （色谱纯，德国默克公司）；醋酸 （色谱纯，美国Tedia公司）；水为怡宝纯净水。

1.3 药材 佛手饮片购买于广州中药饮片厂，经广州中医药大学高明副教授鉴定为芸香科植物佛手Citrusmedical L.var.sarcodactylis Swingle的干燥果实。

2 方法及结果

2.1 佛手的炮制 取佛手饮片8份，各加20%蒸馏水闷润约1 h，分别置于蒸笼中，待圆气后，分别蒸 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，焖过夜，取出，摊开，60℃烘干。分别打粉，过3号筛，即得样品粉末。

2.2 UV法测定总黄酮

2.2.1 对照品的制备 取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含19.96μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品的制备 取样品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80% 甲醇溶液100 mL，超声60 min，过滤，挥干，残渣加10 mL蒸馏水，超声10 min溶解，溶液转移至已处理好的聚酰胺柱，用80mL蒸馏水冲洗，洗脱液弃去，用100 mL80%甲醇洗脱，洗脱液挥干，残渣用80%甲醇溶解，移至25 mL量瓶中，定容备用。

2.2.3 线性关系 精密量取橙皮苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，定容。在330 nm下测定其吸光度，以吸光度 （Y）对橙皮苷质量浓度 （X， mg/mL）进行线性回归，绘制标准曲线图。回归方程为Y=5.526 3X-0.008 7，r=0.999 0，结果表明橙皮苷在9.98～79.84μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4 总黄酮测定 精密量取供试品溶液1 m L，按 “2.2.3”项下方法测定，记录吸光度，每批样品平行测定3次，计算总黄酮的量，结果见表1。

表1 样品中有效成分测定结果 （，n=3）Tab.1 Results of conten t determ ination of sam p les（，n=3）

表1 样品中有效成分测定结果 （，n=3）Tab.1 Results of conten t determ ination of sam p les（，n=3）

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2.3 HPLC法测定橙皮苷及5，7-二甲氧基香豆素

2.3.1 色谱条件

2.3.1.1 橙皮苷 参照 《中国药典》2010年版［1］，Thermo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-水-冰醋酸 （33：63：2）；体积流量1.0 mL/min；检测波长284 nm；柱温30℃；进样量10 μL。橙皮苷保留时间为12.116 min。

2.3.1.2 5，7-二甲氧基香豆素 参照文献［13］，Thermo C18色谱柱；流动相为甲醇-水 （65：35）；体积流量1.0 mL/min；检测波长326 nm；柱温30℃；进样量10μL。5，7-二甲氧基香豆素保留时间为5.016 min。

2.3.2 对照品的制备 取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含40μg的溶液。取5，7-二甲氧基香豆素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 m L含101μg的溶液。

2.3.3 供试品的制备 取样品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察 取橙皮苷对照品溶液，进样2、4、6、8、10、12μL，按照 “2.3.1”项下进样分析，以峰面积 （Y）对橙皮苷的量 （X，μg）进行线性回归，回归方程见表2。

取5，7-二甲氧基香豆素对照品溶液，进样2、4、6、8、10、12μL，按照 “2.3.1”项下进样分析，以峰面积 （Y）对5，7-二甲氧基香豆素的量（X，μg）进行线性回归，回归方程见表2。

表2 橙皮苷和5，7-二甲基香豆素的回归方程Tab.2 Results of linear range of hesperiden and 5，7-dimethoxycoumarin

2.3.5 橙皮苷及5，7-二甲氧基香豆素测定 供试品溶液按 “2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，每批样品平行测定3次，计算橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素的量，结果见表1。

由实验结果可以看出：不同蒸制时间的制佛手样品中总黄酮、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的量均存在差异。随着蒸制不同蒸制时间的延长，样品中总黄酮、橙皮苷的动态变化规律是先增加后降低，其中蒸制2.5 h时量最高，总黄酮为50.416 mg/g，橙皮苷为1.038 mg/g；蒸制4 h时量最低。炮制后5，7-二甲氧基香豆素量明显低于生品，其中蒸2.5 h的样品中5，7-二甲氧基香豆素量为次高，为1.628 mg/g。

2.4 制佛手对DPPH的清除及相关性分析

2.4.1 DPPH溶液的配制 精密称取DPPH对照品8.0 mg，用无水乙醇定容至100 m L的量瓶中，配制成质量浓度为0.08 mg/m L的DPPH溶液，避光保存，现用现配。

2.4.2 供试品的配制 取样品粉末约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇溶液40 m L，超声40 min，过滤，滤渣加无水乙醇30 mL，超声40 min，过滤，合并滤液，即得供试品溶液。

2.4.3 DPPH自由基清除能力测定 参考Kumazawa等［14］的方法并进行改进，分别精密吸取不同体积的供试品至25mL量瓶中，定容，摇匀。取稀释后的供试品溶液3 mL，加入2 mL0.08 mg/mL的DPPH乙醇溶液，摇匀，避光放置30 min后于521 nm处测定吸光值A1。同时测定2 mLDPPH液与3 mL乙醇溶液的吸光度A0及2 mL乙醇与3 m L样品溶液的吸光值A2，计算样品对DPPH自由基的清除率。经IC50软件计算IC50值，结果见表3。

表3 样品对DPPH自由基的清除能力（，n=3）Tab.3 IC50of sam p les for scavenging DPPH free rad ical（，n=3）

表3 样品对DPPH自由基的清除能力（，n=3）Tab.3 IC50of sam p les for scavenging DPPH free rad ical（，n=3）

1 5.35±0.08 1.52 2 0.5 5.13±0.09 1.77 3 1.0 4.55±0.08 1.52 4 1.5 3.36±0.06 1.78 5 2.0 2.51±0.05 1.79 6 2.5 2.39±0.01 0.30 7 3.0 3.16±0.06 1.99 8 3.5 2.92±0.03 1.14 0 9 4.0 5.47±0.26 4.81

由表3可以看出：佛手炮制前后的醇提液对DPPH自由基均有不同程度的抑制作用。其中IC50最小 （即抗氧化能力最强）的为蒸制2.5 h的制佛手（样品6），为2.39 mg/m L，IC50最大为蒸制4 h的制佛手（样品9），为5.47 mg/mL。

2.5 佛手有效成分含有量与抗氧化活性相关性分析 采用SPSS 17.0统计软件对制佛手抗氧化活性IC50、总黄酮、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素进行相关性分析，计算Pearson相关系数，结果见表4。

表4 3种有效成分与抗氧化活性相关系数Tab.4 Cor relation analysis of three com ponents and the antioxidant activity

制佛手总黄酮和橙皮苷含有量与其抗氧化活性之间具有相关性，相关系数分别为-0.891和-0.702，说明抗氧化活性与总黄酮和橙皮苷含有量负相关，含有量越高，IC50值越小，即抗氧化能力越强；佛手中5，7-二甲氧基香豆素的含有量与抗氧化活性之间相关系数0.134，二者之间相关性差。

3 结论

3.1 蒸制过程中，样品中总黄酮、橙皮苷的动态变化规律为先增加后降低，这可能是在一定的蒸制时间内，由于水蒸汽进入组织细胞中，加快后者膨胀，导致细胞间隙变大或组织细胞膜壁破裂，提高其转移率，含有量增加，而长时间蒸制又可能使这些成分流失或分解。另外，炮制后5，7-二甲氧基香豆素的含有量较生品明显下降，约减少25%～46%，原因可能是此类香豆素对热敏感，长时间高温蒸制使其内酯结构开环分解，同时蒸制过程中香豆素类物质容易氧化变质，也可能导致其含有量降低。

3.2 制佛手总黄酮和橙皮苷含有量与其抗氧化活性之间具有相关性，原因可能是黄酮、橙皮苷中含有大量的酚羟基，能向脂质过氧化自由基提供电子，使之转化为较稳定的过氧化脂质，而其自身则转变为酚基自由基，抑制了氧化过程。

3.3 综合总黄酮、橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素这3个考察指标结果，发现蒸制2.5 h后各有效成分达到较高水平，这与佛手喷水后蒸2～3 h的岭南特色炮制工艺［15］相吻合，为合理选择工艺参数提供了参考依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：167.

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［15］广东省卫生厅.广东省中药炮制规范［S］.1984：126.

Effect of steam ing time on m ain com ponents and antioxidant activity of fingered citron

LIShan1， GAO Ming1， CHEN Kang1*， CHEN Yan-xia2， ZHANG Lin-jie1

（1.School of Chinese Materia Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

AIMTo study the effect of different steaming time on the contents of total flavonoids，hesperidin and 5，7-dimethoxycoumarin from fingered citron（Citri Sarcodactylis Fructus）aswell as their antioxidantactivity.METHODSThe total flavonoids contentwasdetermined by ultraviolet spectrophotometry.The contents ofhesperidin and 5，7-dimethoxycoumarin were measured by HPLC.Antioxidant activity was evaluated by scavenging capability for DPPH free radicals.RESULTSThe steaming processmade total flavonoids contentand hesperidin from fingered citron reach the peak values（50.416 mg/g and 1.038 mg/g，respectively），5，7-dimethoxycoumarin content decrease after steaming，at2.5 h when the content decreased leastwas1.628 mg/g，and steamed fingered citron possessed the strongest antioxidant capacity.CONCLUSIONThe steaming time plays a key role in active component content and antioxidant activity，and there exists a correlation between total flavonoid，hesperidin contentand their antioxidantactivity.

fingered citron（Citri Sarcodactylis Fructus）；steaming process；total flavonoids；hesperidin；5，7-dimethoxycoumarin；dynamic change；antioxidant activity

R283

A

1001-1528（2015）04-0821-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.028

2014-09-22

广州市荔湾区科技攻关计划项目 （20122214066）

黎 珊 （1990—），女，硕士生，研究方向为中药炮制现代化和中药饮片质量标准化。Tel：13556191760，E-mail：heyjude1234m@163.com

*通信作者：陈 康 （1961—），男，教授，硕士生导师，研究方向为中药炮制现代化和中药饮片质量标准化。E-mail：chenkang@ gzucm.edu.cn