星点设计-效应面法优化苓柏解毒丸的提取工艺

2015-01-16王萍，李茜，周颖，杨芳

中成药 2015年7期

关键词：面法星点小檗

王萍，李茜，周颖，杨芳

（1.新疆医科大学附属中医医院，新疆乌鲁木齐830000；2.新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐830011）

星点设计-效应面法优化苓柏解毒丸的提取工艺

王萍1，李茜1，周颖2，杨芳2

（1.新疆医科大学附属中医医院，新疆乌鲁木齐830000；2.新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐830011）

目的采用星点设计-效应面法优化苓柏解毒丸的提取工艺。方法以溶媒用量、提取时间为自变量，以盐酸小檗碱的含有量、总多糖的含有量及浸膏得率为评价指标，对自变量各水平进行多元线性回归和二项式拟合，用效应面法选择最佳工艺条件，并进行预测分析。结果确定最优提取工艺为提取2次，加14倍量的水，每次提取60min。结论利用星点设计-效应面法优化苓柏解毒丸的提取工艺，方法简便，预测性良好。

苓柏解毒丸；星点设计；效应面优化法；提取工艺

星点设计（central composite design，CCD）又称中心组合设计，是一种多因素五水平的试验设计。它是在二水平析因设计的基础上加极值点、中心点组成的。因此星点设计与正交、均匀设计相比具有较高的实验精度，并且充分考虑了各因素之间的交互作用，但试验次数增加不多；星点设计所建立的回归模型比后面两种方法更适宜多元非线性模型的拟合，因此能建立拟合度好、相关性高、预测性较好的回归模型；星点设计结合效应面优化法来分析、优化工艺条件更加简单、直观。在工艺优化和处方筛选过程中，常需同时考察多个因素对结果的影响，并对结果进行优化。因此，目前星点设计结合效应面优化法在中药制剂工艺优化和处方筛选方面的应用也越来越多［1-3］。

苓柏解毒丸是根据我院皮肤科专家多年临床实践的经验方开发而成的中药制剂，主要用于治疗脾虚湿盛所致寻常型银屑病、慢性湿疹等疾病，临床疗效较好。处方由土茯苓、黄柏、茯苓和薏苡仁等药材组成。本研究根据处方中各味药材有效成分的理化性质及药理作用，设计将复方中部分药材加水提取。因此采用单因素试验和星点设计-效应面法结合的方法，以盐酸小檗碱和总多糖的含有量及浸膏得率作为综合评价指标，优选了苓柏解毒丸的水提取工艺，为其进一步开发应用提供了科学、合理的理论和实验依据。

1 实验材料

1.1 实验药材土茯苓、黄柏、茯苓和薏苡仁等药材由新疆医科大学附属中医医院药学部提供，经检验均符合《中国药典》2010年版一部各药材项下的规定。

1.2 仪器与试药

1.2.1 仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，美国Waters公司）；AL204型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，0.1 mg］；AG135型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，0.01 mg］；Cintra-20型紫外-可见分光光度计（澳大利亚GBC）；SMART-N型超纯水仪（上海康雷分析仪器有限公司）。

1.2.2 试药盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212，供含量测定用）、D-无水葡萄糖对照品（批号110833-201205，供含量测定用）均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙腈为色谱纯，实验中所用其余试剂如：磷酸、盐酸、硫酸、苯酚、乙醇、十二烷基磺酸钠等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱的测定［4-7］

2.1.1 色谱条件 SymmetryShieldTMRP18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5.0μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（42∶58）（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）；检测波长265 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温40℃；进样量10μL。

2.1.2 对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品6.59 mg，加流动相制成贮备液（质量浓度为0.131 8 mg/mL）。

2.1.3 供试品溶液的制备按处方取各药材，精密称定，加水浸泡1 h，称定质量，回流提取1 h，放冷，再称定质量，并用水补足减失的溶剂量，滤过，滤液浓缩至适量，放冷；按3∶2比例加入盐酸-甲醇溶液（1∶100），摇匀，称定质量，超声处理50 min，放冷，再称定质量，并用盐酸-甲醇溶液（1∶100）补足减失的质量，离心，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性对照样品溶液的制备按 “2.1.3”项下方法制备不含黄柏的阴性对照样品溶液。

2.1.5 专属性试验精密吸取 “2.1.2”、“2.1.3”、“2.1.4”项下溶液各10μL，按 “2.1.1”项下色谱条件分别进样测定。结果供试品与对照品在相同时间点出现同一色谱峰，而阴性对照无干扰。表明本方法有较好的专属性。见图1。

图1 盐酸小檗碱高效液相色谱图

2.1.6 线性关系考察分别精密取 “2.1.2”项下对照品贮备液0.5、1、2、3、4 mL，置5 mL量瓶中，加流动相制成质量浓度为 13.18、26.36、52.72、79.08、105.44 μg/mL的标准系列溶液。按“2.1.1”项下色谱条件分别进样测定。以峰面积积分值对质量浓度进行线性回归，得到其回归方程A=37 945C-32 001，相关系数r=0.999 9。说明盐酸小檗碱在13.18～105.44μg/mL范围内与峰面积积分值有良好的线性关系。

2.1.7 精密度试验吸取同一对照品溶液10μL，重复进样6次，结果其RSD为0.29% （n=6）。表明仪器精密度较好。

吸取同一对照品溶液10μL，连续测定6 d，结果其日间精密度RSD为0.72% （n=6），精密度较好。

2.1.8 重复性试验按处方取同批药材6份，精密称定，照 “2.1.3”项下制备样品溶液，进样测定，结果其RSD为1.97% （n=6），重复性较好。

2.1.9 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于 0、6、12、24、48 h进样测定，结果其RSD为1.80% （n=6）。表明供试品溶液在48 h内稳定性较好。

2.1.10 加样回收率试验取已知含有量的同批样品6份，精密称定，分别精密加入一定量的盐酸小檗碱对照品，按“2.1.3”项下制备样品，进样测定，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.2 提取液中总多糖的测定［8-9］

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取葡萄糖对照品10.9 mg，加水制成对照品贮备液（葡萄糖质量浓度为0.109 0 mg/mL）。

2.2.2 供试品溶液的制备按处方取各药材，精密称定，加水浸泡1 h，称定质量，回流提取1 h，放冷，再称定质量，并用水补足减失的溶剂量，滤过，即得。

2.2.3 葡萄糖最大吸收波长的测定分别精密取葡萄糖贮备液0.4 m L、供试品溶液1 mL，分别置10 m L具塞试管中，分别依次加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL浓硫酸溶液，室温放置10min，置沸水浴中加热20 min，取出迅速冷却至室温。另外精密取1 m L蒸馏水于10 mL具塞试管中，同法制备得空白对照溶液。分别在200～800 nm进行全波长扫描，结果葡萄糖对照品溶液和供试品溶液均在485 nm处有最大吸收。见图2。

图2 葡萄糖对照品和样品的紫外-可见光谱图

2.2.4 线性关系考察分别精密取 “2.2.1”项下对照品贮备液各0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，同“2.2.3”项下方法操作。以吸光度值（A）与对照品的质量（C）进行线性回归，得到其回归方程为A=0.010 779 8 C-0.024 7，相关系数r=0.999 8。说明葡萄糖质量在32.7～76.3μg范围内与吸光度值有较好的线性关系。

2.2.5 精密度试验精密取对照品贮备液0.4 mL共6份，同 “2.2.3”项下方法操作，结果所得吸光度值的RSD为1.55% （n=6），精密度较好。

2.2.6 重复性试验精密取同一供试品溶液1 mL共6份，同 “2.2.3”项下方法操作，结果所得吸光度值的RSD为1.26% （n=6），重复性较好。

2.2.7 稳定性试验精密取供试品溶液1 m L，同“2.2.3”项下方法操作，但显色后分别放置30、45、60、85、100、125、150、180、240 min时，测定吸光度，结果所得吸光度值的RSD为0.77%，表明供试品溶液显色后4 h内较稳定。

2.2.8 加样回收率试验取已知含有量的同批样品6份，精密称定，分别精密加入葡萄糖对照品，照 “2.2.2”项下制备样品，同 “2.2.3”项下方法操作，测定吸光度，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

2.3 提取工艺研究根据处方中各味药材的理化性质和药理作用，确定其中的土茯苓、黄柏等药材采用水提取。本研究采用星点设计-响应面法（CCD-RSM）优选最佳工艺，并进行预测分析和验证性实验。

因提取次数为非连续变量，不能进行回归处理，因此对提取次数采用单因素考察的方法，试验结果见图3。

图3 提取次数的单因素考察

采用盐酸小檗碱和总多糖的含有量及浸膏得率作为提取工艺的综合评价指标，其中盐酸小檗碱含有量的权重系数为40，总多糖含有量为40，浸膏得率为20，满分为100。

2.3.1 浸膏得率测定方法取已恒定质量的蒸发皿，加入精密吸取的供试液20 mL，水浴蒸干，105℃干燥3 h，干燥器中冷却30 min后，迅速精密称定质量，计算浸膏得率。

2.3.2 吸水率的测定取装有水的烧杯，加入48.51 g药材浸泡至透心，用纱布过滤不挤压，沥尽水后，称量充分吸水后的药物质量为105.0 g，吸水率=（105.0-48.51）/ 48.51=1.16。

2.3.3 单因素考察提取次数对综合评分的影响按处方取拟采用水提取的各药材，精密称定，设定其提取时间均为1 h，加水倍量均为8倍，分别提取1、2、3次，考察不同提取次数对综合评分的影响，结果见图3。

由图3可以看出提取2次与3次的综合评分很接近，考虑到生产实际，确定提取次数为2次。

2.3.4 星点设计-效应面法优化提取工艺［10-12］

2.3.4.1 方案设计及结果在预试验基础上，选择对提取试验结果影响较显著的两个因素：提取时间和加水倍量（提取次数根据单因素实验结果确定为2次）。根据星点设计的原理，各因素的极大、极小水平根据预试验的结果，结合工业化大生产，从节约成本的角度考虑。因素水平见表3。

表3 星点设计的因素与水平

按处方取拟采用水提取的各药材，精密称定，按表4安排实验，其中1、2、5、8、12号5个试验是重复试验。分别测定水提液中盐酸小檗碱含有量、总多糖含有量和浸膏得率，计算综合评分。星点设计与结果见表4。

表4 星点设计与结果

2.3.4.2 模型拟合实验所得数据，采用SAS JMP PRO 10.0.2（64bit）拟合模型，并用统计分析软件进行回归分析。

其多元线性回归方程为：Y=63.682 3+6.154 2X1+ 14.543 8X2（P＜0.076 3，r2=0.282 7）。

其中，Y为综合评分，X1为提取时间，X2为加水倍量。结果表明：多元线性回归拟合后复相关系数较低，线性相关性较差。

二次多项式拟合结果为：

其中，Y为综合评分，X1为提取时间，X2为加水倍量。结果表明：二次多项式回归数学模型拟合复相关系数较高，拟合较好。其中加水倍量对综合评分有显著性影响，而提取时间没有显著性影响。

模型拟合结果表明，二项式拟合优于多元线性回归方程。以上述数学模型为基础绘制三维因变量面（Response Surface）和二维等高图，分别见图4、图5。

图4 效应面图

图5 等高线图

2.3.4.3 效应面优化与预测通过对上述三维因变量效应面图和等高线图进行分析，可以看出，综合评分随着加水倍量的增大而增大，随着提取时间的增加而增大。因为加水倍量对综合评分有显著性影响，而提取时间没有显著性影响，因此考虑到生产实际，确定本课题实验的最佳提取工艺为：提取2次，加14倍量的水，每次提取60min。

2.3.4.4 验证试验按处方精密称取样品3份，按照上述预测的最佳提取条件进行验证试验，测定提取液中盐酸小檗碱含有量、总多糖含有量及浸膏得率，结果其综合评分分别为93.56、93.18、92.50，平均综合评分为93.08，而预测综合评分为94.0，偏差为-0.98%，RSD为0.54%。

验证试验结果表明，实际测得的综合评分值比预测值低0.98%，与模型预测值非常接近。说明采用星点设计-效应面法用于苓柏解毒丸提取工艺的优化，结果较准确，得到的工艺条件具有实际应用价值。

3 讨论

在中药研究中，往往需要获取最佳的工艺条件和最佳的处方配比等，而且要求通过适宜的数学方法建立精度高、预测性好的回归模型。因此选择试验设计方法时，要综合考虑试验点的安排，数据处理与回归模型的精度。CCD适宜于回归模型为二次或二次以上的非线性模型的实验［1］。因中药成分复杂且有效成分的含有量相对较低，在提取过程中常常会受到诸多因素的影响，提取方法不同，影响因素也不同，这些因素的变化对结果的影响至关重要，效应面法（response surfacemethodology）就是研究实验结果与实验因素关系的方法。在效应面的一阶设计中通常用正交实验设计和均匀实验设计，而在效应面的二阶设计中，为使实验区在接近响应曲面的最优区域后，能更精确逼近最优值并且识别出最优工艺条件，通常用星点设计、Box-Behnken实验设计及回归实验设计［2］。星点设计-效应面法主要考察自变量对效应变量的作用并对其进行优化。要求自变量必须连续而且可由试验者准确控制［13］。根据星点设计的原理，每个因素设5水平，在本实验中各因素的极大、极小水平主要根据预试验的结果和工业化大生产从节约成本的角度而定。

在测定盐酸小檗碱含有量时，曾采用了多种不同的供试品处理方法及色谱条件进行试验。首先采用了2010年版《中国药典》黄柏项下色谱条件进行了研究，即流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）；柱温30℃；体积流量1 mL/min；检测波长265 nm。结果得到的色谱图中各成分分离度较差。后又采用乙腈-0.03mol/mL磷酸二氢钠（25∶75）［5］、50 mmol/L的磷酸二氢钾溶液-乙腈（55∶45）（以磷酸调节pH至3.0，加入十二烷基硫酸钠至终溶液浓度25mmol/L）［6］、乙腈-0.3%磷酸溶液（20∶80）［7］等多种流动相进行研究，均未能得到理想的色谱图。而当采用色谱条件：乙腈-0.1%磷酸溶液（42∶58）（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）；柱温40℃；体积流量1 mL/min；检测波长265 nm时，得到的色谱图峰形较好，分离度较理想。

因提取液中的盐酸小檗碱含有量较低，因此对提取液进行了浓缩，结果经方法学考察各项指标均符合含量测定的要求。

致谢孙奇老师为本文中的数据统计分析提供帮助。

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