复方四参颗粒提取和精制工艺优化

司爱永， 田 丰， 赵继会， 朴香花， 张永太， 冯年平*

（1.上海中医药大学，上海201203；2.上海市第一人民医院分院，上海200081）

复方四参颗粒提取和精制工艺优化

司爱永1， 田 丰2*， 赵继会1， 朴香花1， 张永太1， 冯年平1*

（1.上海中医药大学，上海201203；2.上海市第一人民医院分院，上海200081）

目的对复方四参颗粒原药材的提取和精制工艺进行优化。方法建立太子参中环肽B定量测定的HPLC方法。采用正交设计，以太子参环肽B的提取率为指标，对提取过程中的提取次数和时间，以及醇沉过程中的乙醇用量和体积分数进行考察。结果方差分析发现，提取次数对太子参环肽B提取率的影响存在显著性差异 （P＜0.05），其提取率随提取次数的增加而上升。最佳提取和精制工艺为加12倍量水提取3次，每次1.5 h，提取液浓缩后加1.5倍量70%乙醇进行醇沉。按最佳工艺进行3次重复实验，结果太子参环肽B的提取率均在60%左右。结论优化后的工艺稳定性良好，采用其对复方四参颗粒原药材进行提取和精制时，主要有效成分太子参环肽B的提取率较高。

复方四参颗粒；太子参环肽B；提取率；正交实验设计

复方四参颗粒源于 “国医大师”张镜人教授的经验方——复方四参饮，作为院内制剂已有近20年的临床应用，前期临床调查了480多例心律失常患者，发现服用该药后总有效率达80%以上。其全方由太子参、南沙参、丹参、苦参、甘草、广郁金、远志 （制）、酸枣仁、莲子心九味药组成，其中太子参、南沙参为君药；丹参、苦参、甘草、广郁金为臣药；远志 （制）、莲子心、酸枣仁共为佐使药。复方四参颗粒益气养阴，扶正以治本；活血清热，祛邪以治标，具有益心气、滋心阴、和心血、宁心神之功效，主治冠心病、病毒性心肌炎等各种心脏病所引起的心律失常、临床胸闷、心悸乏力、气短等症状，而且对过早搏动，如房性早搏、室性早搏等临床疗效较好［1-3］。

为了进一步提高复方四参颗粒的质量，为其新药申报奠定基础，本实验在遵循原有提取方法的基础上，采用正交实验设计［4-7］，选择君药太子参中代表性的有效成分太子参环肽B的提取率为指标，对复方四参颗粒原药材的提取和精制工艺作进一步优化［8-12］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent Technologies公司）；BAS224S型微量电子分析天平（德国Sartorius公司）；Minispin高速离心机（德国Eppendorf公司）；SENCOR206旋转蒸发仪 （上海申生科技有限公司）；JA31002电子天平 （上海精天电子仪器有限公司）。

1.2 试药 太子参 （批号140307-1，产地安徽）、南沙参（批号140218-1，产地吉林）、丹参 （批号140312-1，产地山东）、甘草 （批号 130806，产地甘肃）、苦参 （批号140209-1，产地内蒙古）、广郁金 （批号140220-1，产地广西）、远志 （制） （批号130702-1，产地山东）、酸枣仁（批号140217-1，产地山东）、莲子心 （批号140117-1，产地湖南）（上海万仕诚国药制品有限公司）；太子参环肽B对照品 （中国科学院云南昆明植物研究所谭宁华课题组，纯度99%以上）。

色谱级甲醇、乙腈 （德国 Merck公司，批号P1083040、P1095114）；实验用水为超纯水 （自制）；分析级无水乙醇、95%乙醇 （国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法和结果

2.1 复方四参颗粒原药材提取物中太子参环肽B测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 Spursil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm，Dikma）；检测波长为203 nm；检测器为Agilent1260紫外检测器；体积流量为1 mL/min；柱温为30℃；进样量为20μL；流动相为乙腈和水；洗脱梯度为0～30 min，流动相中乙腈比例从5%上升至50%，之后保持恒定。

2.1.2 标准溶液的制备 精密吸取太子参环肽B对照品10.02mg，置于10 mL棕色量瓶中，甲醇定容，即得对照品贮备溶液。精密吸取对照品贮备液2.0 mL，置于50 mL棕色量瓶中，甲醇定容，即得对照品工作溶液。精密吸取对照品工作溶液0.6、1.2、2.5、5.0、7.5和10 mL，分别置于10mL量瓶中，甲醇定容，即得质量浓度为2.4～40.0 μg/mL的标准溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取复方四参颗粒提取物适量，研细后精密称取10.01 g，置于圆底烧瓶中，加甲醇100 mL，水浴回流1 h，过滤后滤液减压蒸干。残渣加50 mL无水乙醇溶解，过滤后滤液减压蒸干，残渣再加入50 mL乙腈溶解，过滤后滤液减压蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中摇匀，即得供试品溶液。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 取处方量药材 （太子参除外），分别加12倍量水提取3次，每次1.5 h，提取液过滤后合并，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.20（80～85℃），再加入1.5倍量70%乙醇进行醇沉，静置40～48 h，过滤后取上清液，置于圆底烧瓶中，减压蒸干，残渣加50 mL无水乙醇溶解，过滤后滤液减压蒸干，残渣再加入50 mL乙腈溶解，过滤后滤液减压蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中摇匀，即得阴性对照溶液。

2.2 方法学考察

2.2.1 专属性 精密取太子参环肽B标准溶液 （20 μg/mL）、供试品溶液和阴性对照溶液各20μL，HPLC进行分析，所得图谱见图1。由图可知，阴性对照溶液对太子参环肽B的测定没有干扰，表明该方法专属性良好。

图1 专属性考察典型图谱

2.2.2 线性关系 精密吸取太子参环肽B标准溶液各20μL，HPLC进行分析，以色谱峰面积 （Y）对标准溶液的质量浓度 （X）进行线性回归，得线性回归方程Y= 70.522X+13.964，相关系数 （r）为0.999 9，提示在2.4～40.0μg/mL范围内，太子参环肽B的质量浓度与色谱峰面积线性关系良好。

2.2.3 重复性和供试品溶液稳定性 精密称取复方四参颗粒提取物适量，用于制备供试品溶液，在室温下于48 h内重复进样分析。分别记录连续测定5次及0、2、4、8、12、24、36和48 h的色谱峰面积，以所得太子参环肽B色谱峰面积的相对标准偏差 （RSD，%）为指标，考察方法的重复性和供试品溶液的稳定性，结果测得RSD分别为1.16%和1.65%，见表1。由表可知，仪器精密度和方法重复性良好，而且供试品溶液在室温下保存48 h时稳定性理想。

2.2.4 加样回收率 精密称取复方四参颗粒提取物适量，平行3份，按照 “2.1.3”项下方法制备供试品溶液，HPLC进行分析，用于测定供试品溶液中太子参环肽B的含有量。然后，再精密称取太子参环肽B对照品12.50 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，即得质量浓度为1.25 mg/mL的对照品溶液。

表1 供试品溶液稳定性考察结果

精密称取复方四参颗粒提取物适量，平行6份，每份精密加入太子参环肽B对照品溶液1.0mL，按照“2.1.3”项下方法制备加样回收率样品溶液，HPLC进行分析，计算加样回收率样品和供试品溶液中太子参环肽B含有量的差异，用于考察加样回收率，结果见表2。由表可知，太子参环肽B的加样回收率为 （98.45±1.76）%，符合规定。

表2 加样回收率试验结果

2.3 复方四参颗粒的提取和精制工艺优化

2.3.1 实验方法 采用正交实验设计，以太子参环肽B的提取率为指标，对提取过程中的提取次数和时间，以及醇沉过程中的乙醇用量和乙醇体积分数进行考察，因素水平见表3。

表3 复方四参颗粒提取精制工艺优化因素水平

2.3.2 结果和分析 实验分析结果见表4，方差分析结果见表5。由表可知，各因素对太子参环肽B提取率的影响程度为提取次数＞乙醇体积分数＞提取时间＞乙醇用量。其中，提取次数对太子参环肽B提取率的影响具有显著性差异 （P＜0.05），而其他因素无显著性差异 （P＞0.05）。因此，确定最佳提取和精制工艺为加12倍量水提取3次，每次1.5 h，提取液浓缩后加1.5倍量70%乙醇（V/V）进行醇沉。

2.4 验证试验 分别称取处方量药材，平行3份，按照优化后的工艺进行提取和精制，按照 “2.1.3”项下方法制备供试品溶液，HPLC进行分析，以太子参环肽B的提取率为指标，对优化后的工艺进行考察，结果见表6。由表可知，3次实验中太子参环肽B的提取率均在60%左右，表明优化后的提取和精制工艺稳定性理想。

表4 复方四参提颗粒取精制工艺优化结果直观分析

表5 复方四参颗粒提取精制工艺优化结果方差分析

表6 提取和精制工艺验证试验结果(n=3)

3 讨论

复方四参颗粒由九味中药组成，成分比较复杂，并且太子参环肽B属于小分子环肽，紫外吸收较弱，属于末端吸收，各种杂质信号的响应被进一步放大，因而它是方法专属性考察验证时的重点和难点。本实验在供试品和阴性对照品处理过程中，通过应用极性不同的无水乙醇和乙腈来纯化样品，除去部分杂质，从而降低杂质对太子参环肽B测定的影响。另外，在色谱条件考察过程中，本实验以分离度为主要考察指标，通过对柱温、流动相、梯度洗脱条件、检测波长、溶剂等条件的筛选和优化，确保了该方法良好的专属性。

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R284.2

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：1001-1528（2015）07-1592-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.046

2014-09-15

上海市科委生物医药领域科技支撑项目 （12401900503）

司爱永（1987—），男，硕士，研究方向为中药创新制剂。Tel：（021）51323073，E-mail：aiyongsitan@163.com

*通信作者：冯年平 （1967—），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药创新制剂。Tel：（021）51322198，E-mail：npfeng@ hotmail.com田 丰，男，硕士，主管药师，研究方向为中药新药临床前研究和药物代谢基础。Tel：（021）56663031，E-mail：giantison @163.com