复方板蓝根颗粒质量标准的提升研究

郑 程， 王 瑞*， 王峥涛

（1.上海中医药大学中药学院，上海201203；2.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室，上海201203；3.上海中药标准化研究中心，上海201203）

复方板蓝根颗粒质量标准的提升研究

郑 程1， 王 瑞1*， 王峥涛2，3

（1.上海中医药大学中药学院，上海201203；2.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室，上海201203；3.上海中药标准化研究中心，上海201203）

目的提升复方板蓝根颗粒的质量标准。方法采用薄层色谱法，以精氨酸、亮氨酸、（R，S）-告依春和靛玉红作为指标成分进行定性鉴别；采用高效液相色谱法，以尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷作为指标成分进行定量测定。结果薄层色谱斑点清晰，分离度好；尿苷、鸟苷、 （R，S）-告依春和腺苷分别在0.001 7～0.106 0 mg/m L（r=1.000 0）、0.001 6～0.100 2 mg/m L（r=0.999 9）、0.001 6～0.101 1 mg/mL（r=1.000 0）和0.001 5～0.095 9 mg/mL（r=0.999 7）的范围内与峰面积呈良好的线性。尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷的平均回收率 （n=9）分别为100.9%、100.2%，97.8%和100.2%。结论从市售复方板蓝根颗粒26批样品数据综合分析，建议每袋 （15 g）中尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷的总量不得少于1.15 mg，其中 （R，S）-告依春不得少于0.07mg。

复方板蓝根颗粒；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量标准

复方板蓝根颗粒为常用中成药，由板蓝根和大青叶 （600 g∶900 g）制成，具有清热解毒、凉血的功效，用于温病发热、出斑、风热感冒、咽喉肿烂、流行性乙型脑炎、肝炎、腮腺炎等疾病。复方板蓝根颗粒质量标准收载于 《中华人民共和国卫生部药品标准》（中药成方制剂第十二册，WS3-B-2377-97）［1］，仅见理化鉴别项，无专属性指标成分的定性鉴别和定量测定方法。

方中板蓝根和大青叶均收载于 《中国药典》2010年版一部［2］。板蓝根为十字花科菘蓝属植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，主要含有芥子苷及其降解产物、核苷、氨基酸等化学成分［3］。板蓝根现行质量标准以精氨酸为指标成分进行薄层色谱鉴别，以 （R，S）-告依春为指标成分进行薄层色谱鉴别和高效液相色谱定量测定，可实现与南板蓝根的快速鉴别。大青叶为菘蓝的干燥叶，主要含有吲哚生物碱、核苷、氨基酸等化学成分［4］。大青叶现行质量标准以靛蓝为指标成分进行薄层色谱鉴别，以靛玉红为指标成分进行薄层色谱鉴别和高效液相色谱定量测定。

复方板蓝根颗粒质量标准与板蓝根和大青叶现行质量标准不一致，相对滞后，无法保证其临床用药的安全有效。本研究结合文献报道的复方板蓝根颗粒质量评价方法［5-11］和 《中国药典》2010年版一部板蓝根和大青叶质量标准项下的有关方法［2］，以精氨酸、亮氨酸、靛玉红和 （R，S）-告依春为指标性成分，建立薄层色谱鉴别方法；以尿苷、鸟苷、腺苷和 （R，S）-告依春为指标性成分，建立高效液相色谱定量测定方法，完善复方板蓝根颗粒的质量标准，为提高其质量控制方法提供了实验数据，对保证其质量具有重要意义。

1 仪器与试药

薄层色谱自动点样器（Linomat-Ⅵ型，瑞士Camag公司），薄层色谱摄像仪（Reprostar 3型，瑞士Camag公司），高效液相色谱仪（Waters ACQUITY型，美国Waters公司，包括四元泵，柱温箱，自动进样器，PAD检测器和empower工作站），电子分析天平（AE200型，北京Mettler仪器有限公司），数控超声波清洗器 （KQ-250DB型，昆山市超声仪器有限公司）。

甲醇（色谱级，德国Merck公司），Milli Q超纯水（美国Millipore公司）；其他试剂均为分析级（上海国药集团化学试剂有限公司）。HSG薄层色谱硅胶预制板 （批号20110601，烟台江友硅胶开发有限公司）。精氨酸对照品 （批号 110872-200506）、亮氨酸对照品 （批号110876-200204）、靛玉红对照品 （批号110717-200204）、腺苷对照品 （批号110879-200202）、大青叶对照药材 （批号 121367-200602）、板蓝根对照药材 （批号121177-201004），均购自中国药品生物制品检定所；（R，S）-告依春对照品 （批号13-1012，纯度＞98%）由上海中药标准化研究中心提供。市售复方板蓝根颗粒共26批，规格为每袋装15 g（相当原生药15 g），由上海中医药大学郑程收集。

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 氨基酸的薄层色谱鉴别 取本品2 g，研细，加乙醇10 mL，超声30 min，滤过，滤液浓缩至2 mL，作为供试品溶液。另取大青叶对照药材、板蓝根对照药材0.5 g，加乙醇20 mL，同法制成对照药材溶液。再取精氨酸对照品、亮氨酸对照品，加乙醇制成每1mL各含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法 （《中国药典》2010年版附录ⅥB）试验，对照品溶液2μL、对照药材溶液5μL、供试品溶液5μL。分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水 （19∶5∶5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显现相同颜色的斑点。结果见图1。

图1 复方板蓝根颗粒中氨基酸的薄层色谱图Fig.1 TLC chrom atogram of am ino acids in Com pound Banlangen Granules

2.1.2 （R，S）-告依春的薄层色谱鉴别 取本品15 g（1袋），研细，加水50 mL使溶解，加二氯甲烷振摇提取2次，每次50 mL，合并二氯甲烷提取液，浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取板蓝根对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取（R，S）-告依春对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，对照品溶液8μL、对照药材溶液5μL、供试品溶液10μL，分别点与同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯 （1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。结果见图2。

图2 复方板蓝根颗粒中(R,S)-告依春的薄层色谱图Fig.2 TLC chromatogram of(R,S)-goitrin in Compound Banlangen G ranules

2.1.3 靛玉红的薄层色谱鉴别 取 “（R，S）-告依春的薄层色谱鉴别”项下溶液作为供试品溶液。另取大青叶对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取靛玉红对照品，加二氯甲烷制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版附录ⅥB）试验，对照品溶液5μL、对照药材溶液10μL、供试品溶液10 μL。分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-丙酮 （5∶4∶2）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。结果见图3。

2.2 成分定量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 SHISEIDO AQ-C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5μm）；甲醇（A）-水 （B）为流动相，梯度洗脱 （0～3 min，3% ～3%A；3～13 min，3%～7%A；13～15 min，7%～10%A；15～20 min，10%A；20～24 min，10%～13%A；24～40 min，13%A）；体积流量0.8 mL/min；检测波长245 nm；柱温25℃；进样量10μL。理论板数按 （R，S）-告依春和腺苷计算均不低于8 000。在此色谱条件下，复方板蓝根颗粒中尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷与其他组分均能达到基线分离，见图4。

图3 复方板蓝根颗粒中靛玉红的薄层色谱图Fig.3 TLC chromatograms of indirubin in Compound Banlangen Granules

2.2.2 对照品溶液的制备 取尿苷对照品、鸟苷对照品、 （R，S）-告依春对照品和腺苷对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷30μg、30μg、10μg和20 μg的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水20 mL，密塞，称定质量，超声（功率250W，频率40 kHz）15min使溶解，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按照部颁标准中处方比例及生产制备方法，分别制备不含板蓝根、大青叶的样品，按 “供试品溶液的制备”项下操作，得阴性对照溶液。

2.2.5 线性关系考察 分别取尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含尿苷为0.106 0 mg/mL、鸟苷为0.100 2 mg/m L、（R，S）-告依春为0.101 1 mg/mL和腺苷为0.095 9 mg/mL的对照品贮备溶液。分别精密吸取对照品贮备液适量，加水稀释制成含尿苷0.106 0、0.053 0、0.026 5、0.013 3、0.006 6、0.003 3、0.001 7 mg/mL，含鸟苷0.100 2、0.050 1、0.025 1、0.012 5、0.006 3、0.003 1、0.001 6 mg/mL，含 （R，S）-告依春0.101 1、0.050 6、0.025 8、0.012 6、0.006 3、0.003 2、0.001 6 mg/mL，含腺苷 0.095 9、0.048 0、0.024 0、0.012 0、0.006 0、0.003 0、0.001 5 mg/mL的系列溶液，按上述色谱条件测定，进样量10μL，分别以对照品的质量浓度（X）为横坐标，色谱峰面积积分值 （Y）为纵坐标，绘制标准曲线，见表1。

图4 混合对照品 (A),复方板蓝根颗粒 (B),板蓝根阴性对照 (C)和大青叶阴性对照 (D)的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of reference substance (A),Com pound Banlangen G ranules(B), Isatidis Radix negative sam p le(C)and Isatidis Folium negative sample(D)

表1 回归方程、线性范围、定量限和检测限Tab.1 Linearity data and quantitation ranges obtained for four compounds

2.2.6 检测限和定量限 精密量取已知质量浓度的对照品溶液，用水依次稀释制成系列质量浓度由高到低的溶液，测得尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷的检测限（S/N=3）和定量限 （S/N=10），见表1。

2.2.7 精密度试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样测定6次，测得尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷的色谱峰面积的RSD（n= 6）分别为0.4%、1.1%、0.4%和1.1%，精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批号样品 （批号1304107）6份，精密称定，按 “供试品溶液制备”项下操作，按上述色谱条件下进样测定，测得尿苷、鸟苷、 （R，S）-告依春和腺苷的平均含有量（n=6）分别为2.523 mg/袋、1.312 mg/袋、0.468 mg/袋和1.613 mg/袋，RSD分别为0.6%、1.3%、1.0%和0.7%，表明方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验 取样品 （批号1304107）约4 g，精密称定，按 “供试品溶液制备”项下操作，分别在0、1、2、4、8、12、24、48和72 h按上述色谱条件进样，测定供试品溶液中尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷的色谱峰峰面积，RSD（n=9）分别为0.5%、1.9%、1.1%和0.8%，表明供试品溶液在72 h内稳定性良好。

2.2.10 回收率试验 取已知含有量的样品 （批号1304107）9份，各约2 g，精密称定，分别按样品已知成分含有量的50%、100%、150%三个水平加入尿苷、鸟苷、 （R，S）-告依春和腺苷对照品。按 “供试品溶液制备”项下操作，在上述色谱条件下进样测定并计算加样回收率。结果样品中尿苷、鸟苷、 （R，S）-告依春和腺苷平均回收率（n=9）分别为 100.9%、100.2%、97.8%和100.2%，RSD分别为2.1%、2.3%、2.3%和2.6%。见表2～5。

表2 复方板蓝根颗粒中尿苷加样回收率Tab.2 Results of recovery tests for uridine in Compound Banlangen Granules

表3 复方板蓝根颗粒中鸟苷加样回收率Tab.3 Results of recovery tests for guanosine in Compound Banlangen Granules

表4 复方板蓝根颗粒中(R,S)-告依春加样回收率Tab.4 Results of recovery tests for(R,S)-goitrin in Compound Banlangen Granules

表5 复方板蓝根颗粒中腺苷加样回收率Tab.5 Results of recovery tests for adenosine in Compound Banlangen Granules

2.2.11 样品测定 分别取复方板蓝根颗粒样品约4 g，精密称定，按 “供试品溶液制备”项下操作，制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷的量，结果见表6。

3 讨论

本实验建立复方板蓝根颗粒中精氨酸、亮氨酸、 （R，S）-告依春、靛玉红的薄层色谱鉴别方法，以及尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷的高效液相色谱定量测定方法，方法稳定可靠、简便、重复性好，对科学、有效评价复方板蓝根颗粒的质量具有重要意义。

表6 复方板蓝根颗粒成分定量测定结果Tab.6 Test results of sam ples

本研究收集了不同生产企业、同一生产企业不同批号的市售复方板蓝根颗粒样品26批，尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷的测定结果表明：4种成分含有量差异很大，尿苷的含有量范围在0～2.523 2 mg/袋；鸟苷的含有量范围在0～1.312 3 mg/袋；（R，S）-告依春的含有量范围在0～0.468 4 mg/袋，腺苷的含有量范围在0～1.612 8 mg/袋。部分批次样品缺失4种成分中的几种，甚至全部。其中（R，S）-告依春的含有量差异极大，26批样品中仅有12批能够进行定量测定，其余14批均未测得或低于检测限。根据样品测定结果，参考 《中国药典》已有板蓝根、大青叶药材及相关制剂的质量标准，含有量限度按照平均值 （不含NO.26样品）下浮20%计算，建议规定本品每袋含尿苷、鸟苷、（R，S）-告依春和腺苷的总量不得少于1.15 mg； （R，S）-告依春为板蓝根的特征性活性成分［2-3］，含有量限度按照平均值 （不含NO.13～26样品）下浮20%计算，建议规定本品每袋含板蓝根以 （R，S）-告依春计不得少于0.07 mg。

影响复方板蓝根颗粒中有效成分含有量差异的主要原因可能是原料药材的质量差异［12-13］和投料真实性差异，其次是生产工艺的差异。复方板蓝根颗粒现行质量标准滞后严重，且缺乏专属性，无法保证用药的安全有效，因此有必要对其进行质量标准提升研究。

［1］WS3-B-2377-97，复方板蓝根颗粒［S］.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：20，191.

［3］Zhou Wei，Zhang Xiaoyan.Research progress of Chinese herbalmedicine Radix isatidis（Banlangen）［J］.Am JChin Med，2013，14（4）：743-764.

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Improvement of the quality standard for Com pound Banlangen Granules

ZHENG Cheng1， WANG Rui1*， WANG Zheng-Tao2，3*
（1.Schoolof Pharmacy，ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine，Shanghai201203，China；2.Instituteof ChineseMateria Medica，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，The MOF Key Laboratory for Standardization of ChineseMedicines and the SATCM Key Laboratory for New Resources and Quality Fvaluation of Chinese Medicines，Shanghai 201203，China；3.Shanghai R&D Center for Standardization of Traditional Chinese Medicines，Shanghai 201203，China）

AIMTo improve quality standard for Compound Banlangen Granules.METHODSArginine，leucine，indirubin and（R，S）-goitrin as index components were qualitative identified by TLC，and uridine，guanosine，（R，S）-goitrin and adenosine as index components were simultaneously determined by HPLC.RESULTTLC spotswere clear，and separated nicely.The linear ranges of uridine，guanosine，（R，S）-goitrin and adenosine were 0.001 7-0.106 0 mg/mL（r=1.000），0.001 6-0.100 2 mg/mL（r=0.999 9），0.001 6-0.101 1 mg/mL（r=1.000），and 0.001 5-0.095 9 mg/mL（r=0.999 7），respectively.The average recoveries（n=9）of the four compoundswere 100.9%，100.2%，97.8%and 100.2%，respectively.CONCLUSIONFrom comprehensive data analysis，the suggestion is that the total contents of uridine，guanosine，（R，S）-goitrin and adenosine are no less than 1.15mg，especially（R，S）-goitrin content0.07 mg in a bag of Compound Banlangen Granules（15 g）.

Compound Banlangen Granules；TLC；HPLC；quality standard

R927.2

：A

：1001-1528（2015）07-1477-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.018

2014-12-04

国家自然科学基金 （81202883）；国家药典委员会标准提高暨2015版药典科研任务

郑 程（1988—），女，硕士生，主要从事中药质量标准研究。Tel：（021）51322181，E-mail：zhengcheng4231@yeah.net

*通信作者：王 瑞 （1973—），女，博士，教授，主要从事中药活性成分与质量标准研究。Tel：（021）51322181，E-mail：ellewang @163.com