复元胶囊对骨关节炎软骨细胞凋亡中JNK/Bax信号通路的影响

周凌云， 钟 玉， 张玉笛， 李荣亨

（重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆400016）

复元胶囊对骨关节炎软骨细胞凋亡中JNK/Bax信号通路的影响

周凌云， 钟 玉， 张玉笛， 李荣亨*

（重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆400016）

目的探讨复元胶囊对实验性骨关节炎软骨细胞凋亡影响的作用机制。方法体外培养人软骨肉瘤细胞（SW1353），给予白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）刺激，复元胶囊含药血清和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的特异抑制剂SP600125干预，随机分为正常组、模型组、抑制剂组、复元胶囊组、复元胶囊+抑制剂组，流式细胞仪分别检测细胞周期百分率和细胞凋亡率，蛋白质印迹法 （Western blot）检测细胞信号因子磷酸化c-Jun氨基末端活化蛋白激酶（p-JNK）和Bax的蛋白表达。结果IL-1β诱导SW1353后，模型组G1期的百分比增加，S期及G2期的百分比减少，细胞凋亡率显著增高 （P＜0.01）；抑制剂组、复元胶囊组和复元胶囊+抑制剂组G1期的百分比减少，S期及G2期的百分比增加，细胞凋亡率显著降低，p-JNK和Bax表达明显减少 （P＜0.05或P＜0.01），其中以复元胶囊+抑制剂组的各项指标变化最显著 （与模型组比较，P＜0.01）。结论复元胶囊可抑制骨关节炎软骨细胞中p-JNK及下游信号因子Bax的活化和表达，抑制细胞凋亡并促进增殖，可用于防治骨关节炎。

复元胶囊；骨关节炎；JNK；Bax；凋亡

关节软骨退行性病变是骨关节炎（Osteoarthritis，OA）发病的关键环节。研究表明［1］，随着年龄增长，软骨细胞凋亡增加，其数量与骨关节炎呈正相关。复元胶囊是治疗骨关节炎的中药复方制剂，具有补益肝肾、益气活血之功效，但其作用机制尚不清楚。本实验采用流式细胞仪和蛋白质印迹法观察复元胶囊含药血清对IL-1β诱导的体外SW 1353细胞周期、细胞凋亡以及细胞信号因子p-JNK和Bax蛋白表达的影响，探讨其防治骨关节炎可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 主要仪器 倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；CO2细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司）；超净工作台（日本Airtech公司）；电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；流式细胞仪（美国Bekman Coulter公司）；常温高速离心机、冷冻高速离心机 （长沙湘仪离心机仪器有限公司）；低温冰箱 （青岛海尔股份有限公司）；电泳仪、凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 药物与试剂 复元胶囊为自制 （重庆希尔安药业有限责任公司，批号090312）；重组人白介素-1β（美国PeproTech公司）；JNK特异抑制剂SP600125（上海碧云天生物技术有限公司）；一抗4668P Phospho-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）、2772s Bax Antibody（美国CST公司）；二抗ABLP1001A HRP羊抗兔IgG（美国Abgent公司）；内参Anti GAPDH pAb（南京钟鼎生物技术有限公司）。

1.3 动物与细胞 新西兰大白兔3只，体质量（1.9±0.1）kg，重庆医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SYXK（渝）2012-0001；人软骨肉瘤细胞 （SW1353），购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2 实验方法

2.1 细胞的培养与传代 在37℃下5%CO2培养箱中，用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS）的高糖DMEM培养液培养SW1353，倒置显微镜观察细胞生长状态，当细胞长满80%后，开始传代培养。

2.2 含药血清的制备 新西兰大白兔3只，购自重庆医科大学实验动物中心，体质量 （1.9+0.1）kg，随机分为给药组和对照组。给药组2只，体质量分别为1.8和1.9 kg；对照组1只，体质量2.0 kg。给药组按Meeh-Rubner公式灌胃给予等效剂量10倍量的药物 （之前充分溶于生理盐水）；对照组灌胃给予等剂量的生理盐水，每日2次，连续5 d。末次灌胃2 h后，兔颈总动脉插管取血，4℃下过夜，3 000 r/min离心15 min，取上清液，0.22μm滤器除菌，分装备用，-20℃下贮藏。

2.3 实验分组 将细胞以1.5×106个/mL的密度接种于6 cm培养皿中，培养24 h，细胞贴壁后用复元胶囊最佳含药血清浓度 （15%）［2］和SP600125干预细胞进行分组实验，待稳定1 h后，再加入IL-1β（10 ng/mL）刺激细胞。然后，分为正常组（15%空白血清+DMEM培养基）、模型组 （10 ng/m L IL-1β+15%空白血清+DMEM培养基）、抑制剂组（10 ng/mL IL-1β+SP600125+15%空白血清+DMEM培养基）、复元胶囊组（10 ng/mL IL-1β+15%含药血清+DMEM培养基）、复元胶囊+抑制剂组（10 ng/m L IL-1β+SP600125+15%含药血清+DMEM培养基）。在37℃下5%CO2培养箱中培养48 h后，收集细胞。

2.4 流式细胞仪测细胞周期 按一定细胞数接种细胞后，无血清DMEM培养基培养24 h，用于同步化细胞周期。按实验分组加药处理方法培养48 h后收集细胞，300μL PBS加以重悬，逐滴加入预冷的无水乙醇700μL，标记后将标本送往重庆医科大学生命科学研究院流式细胞室检测，实验重复3次。

2.5 流式细胞仪测细胞凋亡 按一定细胞数接种细胞24 h后，按实验分组加药处理方法培养48 h，收集上清液后标记，中和胰酶消化，离心5 min（1 000 r/min），弃上清液，1 mL PBS重悬细胞，再移至5个EP管中，标记后将标本送往重庆医科大学生命科学研究院流式细胞室检测，实验重复3次。

2.6 蛋白印迹法检测细胞信号因子p-JNK和Bax的蛋白表达 细胞培养及分组处理方法同前。继续培养48 h后，分组提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。40μg蛋白/泳道上样，SDS-PAGE电泳分离条带，常规转膜，封闭，TBS-T洗膜，再加入1∶1 000稀释的一抗，4℃下反应过夜，洗膜，二抗室温下孵育1～2 h，洗膜，然后加入ECL化学发光试剂，在BIO-RAD凝胶成像仪下曝光显影，凝胶图像处理系统分析每个条带的灰度值，计算p-JNK/GAPDH、Bax/GAPDH值，重复3次。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析，数据用均数±标准差 （x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05为有统计学意义。

4 结果

4.1 复元胶囊对IL-1β诱导的SW1353细胞周期的影响 与正常组比较，模型组G0/G1期的百分比增加，S期及G2/M期的百分比减少，细胞增殖指数 （PI）减少，差异具有统计学意义 （P＜0.01）；与模型组比较，抑制剂组、复元胶囊组及复元胶囊+抑制剂组的G0/G1期的百分比减少，S期及G2/M期的百分比增加，PI增加，差异有统计学意义 （P＜0.01或P＜0.05），其中复元胶囊组与复元胶囊+抑制剂组作用更为明显 （P＜0.01），且后者的PI大于前者 （P＜0.01），见表1。

表1 复元胶囊对IL-1β诱导的SW 1353细胞周期的影响(x±s)Tab.1 Effects of Fuyuan Capsules on the cell cycle in JL-1 beta induced SW 1353(x±s)

4.2 复元胶囊对IL-1β诱导的SW1353细胞凋亡的影响 与正常组比较，IL-1β诱导模型组的细胞凋亡率显著增高 （P＜0.01）；含药血清及抑制剂干预后，与模型组比较，抑制剂组、复元胶囊组、复元胶囊+抑制剂组的细胞凋亡率均显著降低，差异有统计学意义 （P＜0.01）。其中，复元胶囊组细胞凋亡率低于抑制剂组，而复元胶囊+抑制剂组细胞凋亡率低于复元胶囊组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

4.3 复元胶囊对IL-1β诱导的SW1353细胞信号因子p-JNK和Bax蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组的p-JNK和Bax蛋白表达均明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，干预组的p-JNK和Bax蛋白表达均明显减少 （P＜0.01）；复元胶囊组与抑制剂组比较，p-JNK的表达显著增加（P＜0.01），Bax的表达显著减少 （P＜0.01）；复元胶囊+抑制剂组与抑制剂组比较，p-JNK的表达无明显差异（P＞0.05），而Bax的表达明显减少（P＜0.01）；复元胶囊+抑制剂组与复元胶囊组比较，p-JNK和Bax的表达均显著减少（P＜0.01），见图1和表3。

表2 复元胶囊对IL-1β诱导的SW 1353细胞凋亡的影响(x±s)Tab.2 Effects of Fuyuan Capsules on the apoptosis rate in IL-1 beta induced SW 1353

图1 磷酸化JNK蛋白与Bax蛋白的W estern Blot检测结果Fig.1 Results of p-JNK and Bax datected by W estern blot

表3 复元胶囊对IL-1β诱导的SW 1353细胞信号因子p-JNK和Bax蛋白表达的影响 (x±s)Tab.3 E ffects of Fuyuan Capsules on the expression of p-JNK and Bax in IL-1 beta induced SW 1353(x± s)

5 讨论

骨关节炎（Osteoarthritis）的病理基础是关节软骨退变，而软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞［3］，在软骨形成、代谢以及修复中起着极其重要的作用。凋亡细胞如果不能有效地从软骨中被清除，其产物便可引起病理性的软骨降解，因此以抗凋亡为靶点的干预正逐渐成为治疗骨关节炎的重要方法。骨关节炎在祖国医学中属于 “骨痹”的范畴，气虚血瘀、肝血不足、肾元亏虚是导致发病的根本内因。本实验所用的复元胶囊中含有黄芪、生晒参、丹参、川芎等药用于益气活血化瘀，配以淫羊藿、鹿茸、续断、枸杞子等药用于补益肝肾。前期研究已证实，复元胶囊可通过调节软骨中P38［4］、ERK1/2［5］通路，抑制下游相关凋亡基因如P53、Caspase-3等表达或活化，减少细胞凋亡，降低骨关节炎软骨的退变。

复元胶囊为口服给药，其有效物质需以血液为介质，输送到靶点来产生作用，因而给药后的血清才是真正起作用的 “制剂”，并且血清中含有的成分才是药物在体内起直接作用的物质［6］。故本实验根据血清药理学方法，选用复元胶囊制成含药血清，干预体外培养的SW1353。由于原代软骨细胞培养难度大，易去分化，且涉及伦理学问题，而SW1353与正常人软骨细胞相似，具有良好的软骨细胞表型和功能，体外长期培养表型稳定，故采用SW 1353代替人软骨细胞进行研究［7］。

IL-1β是一种促炎细胞因子，在骨关节炎的病理过程中起着重要作用，故本实验选用IL-1β刺激体外培养细胞来模拟骨关节炎的微环境。JNK家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与P38和ERK同是哺乳动物体内丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）超家族的一员［8］。JNK信号通路能被生长因子、细胞因子 （TNF-α、IL-1）等激活［9］而形成p-JNK，直接调节胞质内靶蛋白的活性（如Bax、Bim等）而介导线粒体途径的细胞凋亡［10］。故本实验从复元胶囊对细胞周期、细胞凋亡及JNK信号通路的角度进一步探讨其防治骨关节炎可能的作用机制。

细胞的周期分布能够反映细胞增殖的具体过程，PI与S期百分比是反映细胞增殖的重要指标［11］。本实验结果显示，用IL-1β刺激SW1353后，细胞增殖情况减弱，用含药血清及抑制剂干预后，PI增加，其中以复元胶囊组及复元胶囊+抑制剂组作用最为明显。由此可知，复元胶囊能调节细胞周期分布，促进细胞增殖。

在骨关节炎病变过程中，软骨细胞凋亡率显著上升［12］。本实验发现，JNK信号通路被IL-1β激活时，其下游基因Bax表达同步增加，而应用复元胶囊含药血清后，p-JNK蛋白表达显著降低，Bax表达和细胞凋亡率也均明显下降，提示复元胶囊能抑制IL-1β诱导的SW1353中p-JNK和Bax的活化和表达，进而抑制IL-1β诱导的细胞凋亡。然而，当用SP600125阻断JNK信号通路后，复元胶囊+抑制剂组与抑制剂组比较，p-JNK表达无明显变化，而Bax表达仍然减少，细胞凋亡率显著降低，推测复元胶囊还可能通过其它信号通路 （如Wnt、NF-κB等）来抑制IL-1β诱导的细胞凋亡，发挥自身独特的多靶点效应。关于复元胶囊是否通过这几条通路共同作用或相互作用，则尚需作进一步研究。

另外实验还表明，复元胶囊抑制IL-1β诱导的细胞凋亡可能是通过抑制p-JNK的活化和表达，进而抑制其信号通路下游凋亡基因Bax的表达，由此减少细胞凋亡，同时促进其增殖，这可能也是复元胶囊防治骨关节炎的作用机制之一。

［1］Hashimoto S，Ochs R L，Rosen F，et al.Chondrocyte-derivedapoptotic bodies and calcification of articular cartilage［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，1998，95（6）：3094-3099.

［2］王泽明.复元胶囊通过MAPKs通路调节OPG-RANKLRANK系统防治骨关节炎的实验研究［D］.重庆：重庆医科大学，2014.

［3］Archer CW，Francis-West P.The chondrocyte［J］.Int JBiochem Cell Biol，2003，35（4）：401-404.

［4］周小莉，李荣亨.复元胶囊对软骨细胞凋亡P38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的影响［J］.第四军医大学学报，2008，29（12）：1092-1095.

［5］周小莉，李荣亨.复元胶囊对软骨细胞凋亡细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路的作用研究［J］.中国老年学杂志，2008，28（4）：329-331.

［6］房 方，李 祥，陈建伟.中药血清药物化学的研究进展［J］.亚太传统医药，2009，5（1）：143-145.

［7］Jia P，Chen G，Zhou G，etal.Fuyuan Decoction inhibits nitric oxide production via inactivation ofnuclear factor-κB in SW1353 chondrosarcoma cells［J］.J Fthnopharmacol，2013，146（3）：853-858.

［8］Hibi M，Lin A，Smeal T，et al.Identification of an oncoprotein-and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain［J］.Genes Dev，1993，7（11）：2135-2148.

［9］Lu Y，Jiang B C，Cao D L，et al.TRAF6 upregulation in spinal astrocytesmaintains neuropathic pain by integrating TNF-α and IL-1βsignaling［J］.Pain，2014，155（12）：2618-2629.

［10］Zhang Y，Li H Y，Zhang Z H，et al.Garlic-derived compound S-allylmercaptocysteine inhibits cell growth and induces apoptosis via the JNK and p38 pathways in human colorectal carcinoma cells［J］.Oncol Lett，2014，8（6）：2591-2596.

［11］陈鸿雁，王 驰，舒 艳，等.苦参碱与3种抗肿瘤药物联合作用对KBV200耐药细胞株细胞周期的影响［J］.中国药房，2006，17（7）：500-501.

［12］Kim H T，Lo M Y，Pillarisetty R.Chondrocyte apoptosis following intraarticular fracture in humans［J］.OsteoarthritisCartilage，2002，10（9）：747-749.

Effects of Fuyuan Capsules on the apoptosis of experimental osteoarthritis chondrocyte in JNK/Bax signaling pathway

ZHOU Ling-yun， ZHONG Yu， ZHANG Yu-di， LIRong-heng*
（Department of Integration of Traditional Chinese and Western Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ABSTRACT：AIMTo investigate themechanism of Fuyuan Capsules on the inhibition apoptosis of experimental osteoarthritis chondrocytes.METHODSHuman chondrosarcoma cellswere cultured and divided into five groups randomly：normal group，model group，inhibitor group，Fuyuan Capsules group，Fuyuan Capsules+inhibitor group.The percentage of cell cycle and apoptosis index were detected by Flow cytometry.The expression of cell signaling factor of p-JNK and Bax were determined by Western blot.RESULTSFuyuan Capsules serum could decrease the percentage of G0/G1phase，but increase the percentage of S phase and G2/M phase in human SW 1353 chondrosarcoma cells IL-1 beta-induced（P＜0.01）.The apoptotic index decreased significantly（P＜0.01）.The levels of p-JNK and Bax were abated significantly（P＜0.01）.CONCLUSIONFuyuan Capsules can decrease the apoptosis index and promote the proliferation associated with p-JNK and Bax in osteoarthritis chondrocyte.Thismay be one of themechanisms about prevention of Fuyuan Capsules in osteoarthritis.

Fuyuan Capsules；osteoarthritis；JNK；Bax；apoptosis

R285.5

：A

：1001-1528（2015）07-1422-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.007

2014-12-12

重庆市卫生局资助项目 （2008-2-35）

周凌云 （1988—），女，硕士，研究方向为风湿病和老年病学。Tel：15922761851，E-mail：421615271@qq.com

*通信作者：李荣亨 （1945—），男，教授，博士生导师，研究方向为中西医结合防治风湿病和老年病。Tel：13320337836，E-mail：Lrongheng1231@163.com