玄参中环烯醚萜类物质的分离纯化工艺

2015-01-16李祚丹季金苟楚莎莎穆小静

中成药 2015年6期

关键词：哈巴萜类玄参

李祚丹，季金苟，楚莎莎，何慧，穆小静，徐溢

（重庆大学化学化工学院药学系，重庆400044）

玄参中环烯醚萜类物质的分离纯化工艺

李祚丹，季金苟*，楚莎莎，何慧，穆小静，徐溢

（重庆大学化学化工学院药学系，重庆400044）

目的提高玄参中环烯醚萜类物质的分离纯化效果。方法以哈巴俄苷的吸附率和解吸率为评价指标，筛选树脂，优化吸附和解吸条件，并重点考察了pH对其的影响。结果HPD100型大孔吸附树脂能较好地分离纯化玄参中环烯醚萜类物质。在样品溶液pH 4，吸附时间48 h条件下，对哈巴俄苷吸附率可达95.58%；在洗脱剂为80%乙醇，pH 8，6 BV条件下，对其解吸率可达95.35%。结论HPD100型大孔吸附树脂对玄参中环烯醚萜类物质有较好的分离纯化作用，并且适当调节样品和洗脱液的pH可进一步提高其效果。

玄参；环烯醚萜；哈巴俄苷；大孔吸附树脂；分离纯化

环烯醚萜是我国传统中药玄参中的一类化学物质［1-2］，具有多种药理活性，如抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗细胞染色体诱变、促进胰腺分泌、增强免疫作用，并且还对心血管系统、神经系统、消化系统有影响［3-4］。按结构分类，玄参中的环烯醚萜可分为取代环戊烷环烯醚萜苷和环戊烷开裂的裂环式环烯醚萜苷，代表性物质为哈巴苷、哈巴俄苷［1，5］。目前，常用硅胶柱层析法分离纯化该类成分时存在成本高、再生处理不方便等缺点，而大孔吸附树脂具有比表面积大、吸附容量高、选择性好、吸附速度快、再生处理方便、使用周期长等诸多优点，因而是目前的研究热点［6-7］。本实验用大孔吸附树脂对玄参中环烯醚萜类物质的分离纯化进行了研究，除了考察常规的吸附时间、洗脱剂浓度等因素对吸附率和解吸率的影响［8-10］外，还重点关注了pH对其的影响，以期得出更好的分离纯化工艺。

1 仪器、材料与试剂

1.1 仪器设备 T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；THZ-C恒温震荡箱（江苏太仓市实验设备厂）；KQ-2200B超声波清洗器（巩义市予华仪器有限责任公司）；RE-2000A旋转蒸发仪（上海嘉鹏科技有限公司）；Phs-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）。

1.2 材料与试剂哈巴俄苷对照品（纯度＞98%，西安朗鸿生物科技有限公司）；玄参（重庆中药材公司）；NKAII、AB-8、D101大孔吸附树脂（南开大学化工厂）；HPD100、HPD450大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）。甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、盐酸（分析纯，重庆川东化工集团有限公司）；氢氧化钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。

2 方法

2.1 样品溶液制备称取玄参干燥根部50 g，切块，5倍量水浸泡24 h，70℃下加热回流3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩得浸膏，加适量水溶解，依次用乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次［2］。之后将正丁醇部分减压浓缩，再加水溶解，定容至1 000mL，备用。

2.2 标准曲线的建立鉴于哈巴俄苷为玄参中环烯醚萜类成分的代表性物质［5］，且《中国药典》在鉴别玄参药材时也以其为参考标准［11］，故本实验以哈巴俄苷为玄参中环烯醚萜类物质的指标。

精密称取哈巴俄苷对照品0.027 2 g，30%甲醇溶解，定容至50 mL，精密吸取其中2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 m L，分别置于1～5号10 mL量瓶中，30%甲醇定容。以30%甲醇溶液为参比，在190～600 nm范围内光谱扫描，在最大吸收波长处以质量浓度X（mg/mL）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得到回归方程。

2.3 大孔吸附树脂的预处理在树脂柱内加入高于树脂层10 cm的乙醇，浸泡24 h后放出浸液，蒸馏水反复洗涤至洗涤液加水稀释不浑浊，并且紫外光谱扫描时无吸收峰出现为止。

2.4 大孔吸附树脂的选择精密称取AB-8、D101、HPD100、HPD450、NKA-II5种树脂各5.00 g，置于具塞锥形瓶中，分别加入样品溶液50.00 mL，30℃下振摇吸附48 h，测定溶液中哈巴俄苷的质量浓度，计算吸附率。再将吸附后的树脂过滤，60%乙醇50.00 mL振荡解吸24 h，测定解吸液中哈巴俄苷的质量浓度，计算解吸率，以筛选出最适宜分离纯化玄参中环烯醚萜类物质的树脂。吸附率和解吸率按公式（1）和（2）计算。

注：ρ0为吸附前溶液质量浓度（mg/m L）；ρ1为吸附后溶液质量浓度（mg/mL）；ρ2为解吸液质量浓度（mg/m L）；V1为样品溶液体积（mL）；V2为解吸液体积（mL）。

2.5 分离纯化条件的研究

2.5.1 样品溶液pH对吸附率的影响取8份样品溶液各50 mL，以0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH将其pH分别调为3、4、5、6、7、8、9、10，置于8个装有5.00 g经预处理的树脂的锥形瓶中，30℃下振荡吸附48 h，测定溶液中哈巴俄苷的质量浓度，计算吸附率。

2.5.2 静态吸附时间对吸附率的影响取经预处理的树脂5.00 g，置于锥形瓶中，精密加入200.00 mL“2.5.1”项的样品溶液，30℃下每隔4 h取样一次，测定溶液中哈巴俄苷的质量浓度，计算吸附率。之后将吸附饱和的大孔树脂悬浮液离心，除去残液及树脂表面水分，留待备用。

2.5.3 乙醇体积分数对解吸率的影响向锥形瓶中加入已达到吸附平衡的树脂5.00 g，再分别加入50.00 mL不同体积分数的乙醇溶液进行洗脱，30℃下振荡解吸24 h，收集各乙醇体积分数下的洗脱液，分别测定各洗脱液中哈巴俄苷的质量浓度，计算解吸率。

2.5.4 洗脱剂pH对解吸率的影响向锥形瓶中加入已达到吸附平衡树脂的5.00 g，再分别加入pH分别为5、6、7、8、9、10的洗脱剂50.00 mL，30℃下振荡解吸24 h，收集各pH下的洗脱液，分别测定各洗脱液中哈巴俄苷的质量浓度，计算解吸率。

2.5.5 洗脱剂用量对解吸率的影响取已达到吸附平衡的树脂5.00 g装柱，2.0 mL/min体积流量下用“2.5.4”项的洗脱剂洗脱，每10.00 mL为1份收集，分别测定每份洗脱液中哈巴俄苷的质量浓度，计算解吸率。

3 结果

3.1 标准曲线的建立通过光谱扫描，确定哈巴俄苷的检测波长为283 nm，以对照品质量浓度X（mg/mL）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程Y=1.455 9X+0.060 8，r2=0.999 3，表明哈巴俄苷在0.108 8～0.544 mg/mL范围内线性关系良好。

3.2 不同型号大孔吸附树脂对玄参中环烯醚萜分离效果的影响表1为不同型号大孔吸附树脂对哈巴俄苷分离效果的影响。表1所示，5种树脂的吸附和解吸性能有所差异，其中HPD100型大孔吸附树脂对哈巴俄苷吸附和解吸效果最好，吸附率能达到95.56%，而解吸率能达到86.21%。综合考虑，本实验选择HPD100型大孔吸附树脂用于分离纯化玄参中的环烯醚萜类物质。

表1 大孔吸附树脂的筛选（n=3）

3.3 样品溶液pH对吸附率的影响图1为样品溶液pH对吸附率的影响，由图可见，该影响较大。pH＜4时，树脂对哈巴俄苷的吸附率随pH的增加而上升；pH4时，吸附率达到最大；pH＞4时，吸附率会显著下降。推测可能是由于HPD-100大孔吸附树脂是苯乙烯型非极性共聚体，因而对非极性物质作用力较强的缘故。哈巴俄苷等环烯醚萜类化合物是一类含有较多羟基的弱酸性物质，在pH4时，以分子状态存在居多，故与HPD-100大孔吸附树脂作用力较强；酸性增强时，可能会产生较多的羟基质子化物质，因而与该型号树脂作用力减弱；碱性增加时，以共轭碱负离子形式存在，因而与该型号树脂作用力减弱。

图1 样品溶液pH对吸附率的影响

3.4 吸附时间对吸附率的影响图2为吸附时间对吸附率的影响，由图可见，随着时间的延长，树脂对哈巴俄苷的吸附率逐渐增大。0～20 h内，吸附率增长较快；20 h后，吸附率增长趋势变缓；48 h时，吸附基本达到平衡状态。由此可知，最佳静态吸附时间为48 h。

图2 吸附时间对吸附率的影响

3.5 乙醇体积分数对解吸率的影响图3为乙醇体积分数对解吸率的影响，由图可见，该影响较大。乙醇体积分数小于50%时，解吸率随乙醇体积分数的增大而上升，且上升趋势较快；乙醇体积分数大于50%时，解吸率上升趋势变缓；乙醇体积分数为80%时，解吸率最大，达93.02%；乙醇体积分数进一步增大时，解吸率缓慢降低。推测可能是由于哈巴俄苷等环烯醚萜类化合物具有一定极性，因而用极性越接近的溶剂洗脱，其解吸率越高，而且极性相差越大，其解吸率越小。这也从另一方面说明，80%左右的乙醇可能与哈巴俄苷极性相当。

图3 乙醇体积分数对解吸率的影响

3.6 洗脱剂pH对解吸率的影响图4为洗脱剂pH对解吸率的影响，由图可见，该影响较大，而且弱酸性物质易于被弱碱性介质洗脱。pH＜8时，解吸率随pH的增大而上升；pH 8时，解吸率最大，达94.65%；pH＞8时，解吸率明显降低，表明溶液的pH值直接影响弱酸性物质的存在形式和极性情况。另外图4还显示，80%的乙醇与pH 8时的哈巴俄苷等环烯醚萜类化合物的极性更为接近，因而解吸率更大。

图4 洗脱剂pH对解吸率的影响

3.7 洗脱剂用量对解吸率的影响图5为洗脱剂用量对解吸量的影响，由图可见，用量为0～3 BV时，解吸率的上升趋势较快；用量为6 BV时，解吸率最大，可达到95.35%；用量进一步增大时，解吸率上升趋势明显变慢。综合考虑目标产物的解吸率和洗脱剂的经济成本等因素，本实验选择6 BV的洗脱剂用量。

4 讨论

图5 洗脱剂用量对解吸率的影响

综合考虑5种大孔吸附树脂对哈巴俄苷的吸附和解析性能时发现，HPD100树脂最适宜用于分离纯化玄参中的环烯醚萜，对哈巴俄苷的吸附率和解吸率可分别达到95.56%和90.46%。本实验最佳工艺条件为：玄参样品溶液pH为4，最佳静态吸附时间为48 h，在此条件下对哈巴俄苷的吸附率为95.56%；洗脱剂为6 BV、pH为8的80%乙醇溶液，在此条件下对哈巴俄苷的解吸率可达到95.35%。

由此可见，HPD100型大孔吸附树脂适宜用于分离纯化玄参中的环烯醚萜类物质，而且适当调节样品和洗脱剂的pH值，对吸附率和解吸率都有较大的提高。

［1］张刘强，李医明.近10年玄参属植物化学成分和药理作用研究进展［J］.中草药，2011，42（11）：2360-2368.

［2］姜守刚，蒋建勤，祖元刚.玄参的化学成分研究［J］.植物研究，2008，28（2）：254-256.

［3］胡瑛瑛，黄真.玄参的化学成分及药理作用研究进展［J］.浙江中医药大学学报，2008，32（2）：268-270.

［4］夏聪华，石森林，葛卫红，等.玄参药理活性研究进展［J］.中国药师，2008，11（8）：911-913.

［5］郑礼胜，刘向前.环烯醚萜类研究进展［J］.天然产物研究与开发，2009，21（4）：702-711.

［6］张静泽，陈虹，白淑芳.大孔吸附树脂在中草药活性成分研究中的应用［J］.辽宁中医学院学报，2004，6（4）：290-291.

［7］何丙林，黄文强.离子交换与吸附树脂［M］.上海：上海科学技术出版社，1995.

［8］姚干，何宗玉，方积年.大孔吸附树脂纯化栀子中总环烯醚萜苷和栀子苷的研究［J］.中草药，2006，37（1）：57-59.

［9］李茂星，贾正平，胡之德.大孔树脂富集纯化藏药独一味总环烯醚萜苷［J］.中国中药杂志，2007，32（17）：1743-1746.

［10］丁霞，余宗亮，杜伟峰，等.SP825-大孔树脂富集山茱萸环烯醚萜苷的工艺探索［J］.中成药，2008，30（1）：53-56.

［11］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：108-109.