风梅颗粒中齐墩果酸、熊果酸、二羟基泽兰素和腺苷的测定

2015-01-16伍婉媚

中成药 2015年6期

关键词：泽兰齐墩枇杷叶

伍婉媚，张超

（1.广州医科大学药学院，广东广州510182；2.广州市妇女儿童医疗中心，广东广州510623）

风梅颗粒中齐墩果酸、熊果酸、二羟基泽兰素和腺苷的测定

伍婉媚1，2，张超1*

（1.广州医科大学药学院，广东广州510182；2.广州市妇女儿童医疗中心，广东广州510623）

目的建立测定风梅颗粒（东风桔、岗梅、枇杷叶、山白芷、广东土牛膝、紫苏梗、薄荷脑）中齐墩果酸、熊果酸、二羟基泽兰素和腺苷的方法。方法采用高效液相色谱法。测定齐墩果酸和熊果酸的色谱柱为Agela venusil XBP-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇-0.05 mol/L醋酸铵溶液（88∶12）；柱温为室温；体积流量1.0 mL/min；进样量20μL；检测波长为215 nm。测定二羟基泽兰素和腺苷的色谱柱为Diamonsil C18（4.6 mm×250mm，5μm）；以乙腈为流动相A，0.2%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；柱温为30℃；检测波长为0～20 min时260 nm，20～60 min时240 nm。结果齐墩果酸和熊果酸线性范围分别为2.5～15μg、5～30μg（r≥0.999 0）；平均回收率分别为100.6%和100.4%。二羟基泽兰素和腺苷线性范围分别为1.05×10-2～6.3×10-2μg、0.101～0.606μg（r≥0.999 0）；平均回收率分别为101.0%、100.3%。结论该方法可用于风梅颗粒中齐墩果酸和熊果酸、二羟基泽兰素和腺苷的定量测定，准确可靠。

风梅颗粒；齐墩果酸；熊果酸；二羟基泽兰素；腺苷

风梅颗粒由东风桔、岗梅、枇杷叶、山白芷、广东土牛膝、紫苏梗、薄荷脑7味中药组成，功效镇咳祛痰，用于治疗伤风感冒，支气管炎等引起的咳嗽，被收载于《国家中成药标准汇编》内科肺系（二）分册，执行标准WS-11423（ZD-1423）-2002［1］。但原质量标准仅对东风桔和枇杷叶进行了简单的显色鉴别，未对处方中其他药材进行控制。为进一步提高风梅颗粒的质量控制标准，确保用药安全可控，本实验采用高效液相色谱法对其中用量较大的枇杷叶和广东土牛膝的主要成分齐墩果酸、熊果酸、二羟基泽兰素和腺苷进行测定方法研究。

1 试药与仪器

LC-20ATVP型高效液相色谱仪、SPD-20AVP型紫外可见检测器（日本岛津公司），HW-2000色谱工作站（南京千谱软件有限公司）。齐墩果酸（纯度98%，批号110709-201205）、熊果酸（纯度98%，批号110742-201218）、二羟基泽兰素（纯度97%，批号2012081）、腺苷（纯度99%，批号2012018）对照品，均购于上海江莱生物科技有限公司；风梅颗粒（自制，每袋装10g，批号分别为20130615、20130616、20130617）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海江莱生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 齐墩果酸和熊果酸的测定［2-9］

2.1.1 对照品混合溶液制备精密称取齐墩果酸和熊果酸对照品适量，甲醇溶解，摇匀，即得对照品混合溶液（齐墩果酸质量浓度为0.5 mg/mL，熊果酸质量浓度为1.0 mg/mL）。

2.1.2 供试品溶液配制精密称定本品5.0 g，研细，置于具塞锥形瓶中，甲醇10 mL溶解，超声处理（300 W，25 kHz）30 min，加甲醇补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性供试品溶液配制按风梅颗粒处方和工艺，制备不含枇杷叶的阴性样品和阴性供试品溶液。

2.1.4 色谱条件及系统适应性 Agela venusil XBP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-0.05 mol/L醋酸铵溶液（88∶12）；柱温为室温；体积流量 1.0 mL/min；进样量20μL；检测波长为215 nm。在此条件下，齐墩果酸和熊果酸与其他组分分离效果良好，且阴性样品无干扰。另外，以齐墩果酸和熊果酸计，理论塔板数应不低于2 500，分离结果见图1。

图1 齐墩果酸和熊果酸的HPLC

2.1.5 线性范围考察精密吸取对照品混合溶液5、10、15、20、25、30μL，按 “2.1.4”项下色谱条件测定，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，齐墩果酸和熊果酸量（X）为横坐标分别绘制标准曲线，得到回归方程。齐墩果酸为Y=2.187 4X+1.080，r=0.999 2，线性范围2.5～15μg；熊果酸为Y=1.025 1X+2.007 9，r=0.999 5，线性范围5～30μg。

2.1.6 精密度试验精密吸取 “2.1.1”项下混合对照品溶液20μL，连续进样6次，按 “2.1.4”项下色谱条件，测定齐墩果酸和熊果酸的峰面积，两者RSD分别为0.3%和0.7%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验精密称取批号为20130615的样品，按 “2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，分别测定齐墩果酸和熊果酸的峰面积，两者RSD分别为0.5%和0.3%，表明重复性良好。

2.1.8 稳定性试验精密吸取批号为20130615的样品，于0、1、2、4、6、8 h测定齐墩果酸和熊果酸的峰面积，两者RSD分别为0.5%、0.5%，表明供试品溶液8 h内稳定性良好。

2.1.9 加样回收率分别称取批号为20130615的含有量已知的样品（齐墩果酸9.66 mg/袋，熊果酸17.68 mg/袋）适量，精密加入另配的对照品混合溶液1mL（熊果酸质量浓度为5.13 mg/mL，齐墩果酸质量浓度为2.60 mg/mL），即得供试品溶液，测定，结果见表1。可见其平均回收率分别为100.6%和100.4%，RSD分别为1.5%和0.7%，符合分析要求。

表1 齐墩果酸和熊果酸回收率试验结果（n=6）

2.2 样品中二羟基泽兰素和腺苷的测定［10-13］

2.2.1 对照品混合溶液的制备分别精密称取二羟基泽兰素和腺苷对照品适量，流动相溶解，摇匀，即得对照品混合溶液（二羟基泽兰素质量浓度为2.1μg/mL，腺苷质量浓度为20.2μg/mL）。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称取本品10 g，加水20 mL溶解，60℃下超声提取30 min，乙酸乙酯萃取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，浓缩蒸至0.5 mL，流动相溶解，定容至10 mL，摇匀，微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备按风梅颗粒处方和工艺，制备不含广东土牛膝的阴性样品和供试品溶液。

2.2.4 色谱条件及系统适应性 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈为流动相A，0.2%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0～20 min，22%A；20～30 min，22%A→65%A；30～60 min，65%A）；体积流量1.0 mL/min；柱温为30℃；检测波长为0～20 min时260 nm，20～60min时240 nm。在此条件下，二羟基泽兰素和腺苷与其他组分离效果良好，且阴性样品无干扰。另外，以二羟基泽兰素和腺苷计，理论塔板数应不低于2500，分离结果见图2。

图2 二羟基泽兰素和腺苷的HPLC

2.2.5 线性范围考察精密吸取对照品混合溶液5、10、 15、20、25、30μL，按 “2.2.4”项下色谱条件测定，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，二羟基泽兰素和腺苷量（X）为横坐标分别绘制标准曲线，得到回归方程。二羟基泽兰素为Y=4.581 5X+0.858 3，r=0.999 9，线性范围1.05×10-2～6.3×10-2μg；腺苷为Y=0.229 9X-0.393 3，r=0.999 5，线性范围0.101～0.606μg。

2.2.6 精密度试验精密吸取 “2.2.1”项下混合对照品溶液20μL，连续进样6次，按 “2.2.4”项下色谱条件，测定二羟基泽兰素和腺苷的峰面积，两者RSD分别为0.4%和0.6%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验精密称取批号为20130615的样品，按 “2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，分别测定二羟基泽兰素和腺苷的含有量，两者RSD分别为0.9%和0.7%，表明本方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验精密吸取批号为20130615的样品，于0、1、2、4、6和8 h测定二羟基泽兰素和腺苷的峰面积，两者RSD分别为1.0%和1.0%，表明供试品溶液8 h内稳定性良好。

2.2.9 加样回收率试验分别称取批号为20130615的含有量已知的样品（二羟基泽兰素 21.25μg/袋、腺苷225.36μg/袋）适量，精密加入另配的对照品混合溶液1 mL（二羟基泽兰素质量浓度为10.51μg/mL，腺苷质量浓度为113.23μg/mL），即得供试品溶液，测定，结果见表2。可见其平均回收率分别为100.9%和100.3%，RSD分别为1.1%和0.8%，符合分析要求。

表2 二羟基泽兰素和腺苷回收率试验结果（n=6）

2.3 样品测定取3批样品按 “2.1”项和 “2.2”项下方法测定，结果见表3。

表3 样品测定结果（x±s，n=3）

3 讨论

3.1 枇杷叶和广东土牛膝为风梅颗粒主要成分。枇杷叶归肺、胃经，具有清肺止咳、降逆止呕等功效，临床上用于肺热咳嗽、气逆喘急、胃热呕逆、烦热口渴［14-15］；广东土牛膝为菊科泽兰属植物，有祛风、消肿、清热、解毒、行瘀等功效，主治白喉、乳蛾、咽喉肿痛、吐血、咯血、血淋、外伤肿痛、跌打瘀痛等症状［16-18］。另外，齐墩果酸和熊果酸为枇杷叶主要成分，而二羟基泽兰素和腺苷为广东土牛膝主要成分。本实验采用高效液相色谱法对风梅颗粒中齐墩果酸、熊果酸、二羟基泽兰素、腺苷进行定量测定方法研究，对完善本品的质量标准具有十分重要的作用，能有效控制产品的内在质量。

3.2 检测波长的选择分别取齐墩果酸和熊果酸对照品适量，加流动相溶解，制成每1 mL含0.10 mg的溶液，按紫外—可见分光光度法在200～400 nm波长处进行紫外扫描。结果发现，齐墩果酸和熊果酸对照品在215 nm处均有最大吸收，故检测波长定为215 nm；分别取二羟基泽兰素和腺苷对照品适量，加流动相溶解，前者制成每1 mL含1.5μg的溶液，后者制成每1 mL含8.2μg的溶液，按紫外—可见分光光度法在200～400 nm波长处进行紫外扫描。结果发现，前者在240 nm处有最大吸收，后者在260 nm处有最大吸收，故检测波长分别定为240 nm和260 nm。

［1］WS-11423（ZD-1423）-2002，风梅颗粒［S］.

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