桃仁中苦杏仁苷及多糖的闪式提取工艺

2015-01-16吴兆宇郝鹏飞冯素香刘富岗李建生李晓玉

中成药 2015年6期

关键词：药渣桃仁转移率

吴兆宇，郝鹏飞，冯素香*，刘富岗，李建生，李晓玉

（1.河南中医学院，河南郑州450046；2.南阳理工学院，河南南阳473000）

桃仁中苦杏仁苷及多糖的闪式提取工艺

吴兆宇1，郝鹏飞2，冯素香1*，刘富岗1，李建生，李晓玉1

（1.河南中医学院，河南郑州450046；2.南阳理工学院，河南南阳473000）

目的通过比较闪式提取法和回流提取法对桃仁有效成分的提取效果，选择较优的提取方案。方法以苦杏仁苷的量及转移率为指标，进行闪式提取正交设计，正交最优结果与乙醇回流法提取的结果进行对比，并对闪式提取及回流提取苦杏仁苷后的药渣进行回流提取多糖，对其多糖的提取率进行比较。结果闪式提取最优工艺提取苦杏仁苷的含有量为2.50 mg/g，转移率为71.48%；回流提取苦杏仁苷的含有量为2.26 mg/g，转移率为64.61%；闪式提取法和回流提取法的药渣中多糖的出膏率分别为7.32%和5.91%。结论闪式提取的苦杏仁苷的提取率及药渣中多糖的出膏率均高于回流提取苦杏仁苷的提取率及药渣中多糖的出膏率。

闪式提取；回流提取；苦杏仁苷；正交设计；多糖

桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch或山桃Prusua davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟种子；性苦、甘，归心、肝、大肠经；有活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘的功能；常用于经闭痛经，癥瘕痞块，肺痈肠痈，跌扑损伤，肠燥便秘，咳嗽气喘［1］。现代药理研究表明，桃仁醇提取物具有抗过氧化作用，可以改善记忆力，延缓衰老［2］；其水提取物能改善寒凝血瘀证和瘀热互结证大鼠的血液循环障碍，对内脏有不同的保护作用［3］及抗皮肤过敏及抗氧化性［4］等功效；桃仁油可显著降低模型动物的血黏度，增大动静脉口径［5］。目前对其苦杏仁苷及多糖等有效成分的提取方法的研究有回流提取法［6］、水酶法［7］、超声提取法［8］等，但尚未见到用闪式提取法提取桃仁的有效成分，本实验针对此工艺对其进行研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 JHBE-50闪式提取器（河南金鼎科技发展有限公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（配Waters2998紫外检测器，Empower色谱工作站）；KH2200DB型超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；UV-2450型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；XS105型电子分析天平（瑞士梅特勒仪器有限公司）；SHE-D（III）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 试药苦杏仁苷（批号110820-201004），D-无水葡萄糖（批号110833-200904）均购于中国食品药品检定研究院；桃仁药材购于张仲景大药房，由河南中医学院药学院陈随清教授鉴定为蔷薇科植物桃P.persica（L.）Batsch的干燥成熟种子；乙腈（色谱纯，Fisher Scientific公司），磷酸、无水乙醇、丙酮、乙醚（以上试剂均为分析纯），水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 苦杏仁苷的测定

2.1.1 色谱条件 Venusil XBP-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm，博纳艾杰尔科技有限公司），以乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）为流动相；体积流量1.0 mL/min，柱温为25℃，检测波长为207 nm。理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于7 000。苦杏仁苷对照品及供试品的色谱图，见图1。

图1 对照品（A）和供试品（B）HPLC图

2.1.2 标准曲线精密称取干燥至恒定质量的苦杏仁苷对照品20.10 mg，至50 m L的量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，作为对照品贮备液0.402 mg/mL。精密量取配置好的苦杏仁苷对照品溶液0.5、1、2、4、5、10 mL分别置10 m L量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀。精密吸取上述稀释对照品溶液20μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以对照品进样质量浓度（mg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线：Y=1.7× 106X-4.2×105，r=0.999 0。结果表明苦杏仁苷在0.020 1～0.402 mg/mL质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

2.1.3 精密度试验精密吸取对照品溶液，重复进样6次，每次20μL，记录峰面积，结果相对标准偏差（RSD）为1.18%，表明仪器精密度好。

2.1.4 稳定性试验取一份样品约10 mg，精密称定，精密加入甲醇5 m L，使完全溶解，过滤，精密量取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液，分别于配制后的0、1、2、4、6、8、12 h进样，测定苦杏仁苷的峰面积，其相对标准偏差（RSD）为1.24%，说明供试品溶液在常温下12 h内稳定。

2.1.5 重复性试验取样品6份，按 “2.1.4”项下方法处理制得6份供试品溶液，并按 “2.1.1”项下色谱条件进样，结果苦杏仁苷的RSD为1.30%，表明方法的重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验取已经测定含有量的样品9份，每份5 mg，精密称定，随机分成3组，每组3份，按照供试品中苦杏仁苷的含有量，以其80%、100%、120%比例精密加入对照品贮备液，挥干甲醇后加入样品，按“2.1.4”项方法处理并按 “2.1.1”项下色谱条件进样，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.2 闪式提取方法的考察

2.2.1 闪提电压的考察在进行正交试验前，先对其电压进行单因素考察，分别取100 V、120 V、140 V不同水平进行试验。取桃仁药材，粉碎成粗粉，先用石油醚回流提取1 h，弃石油醚，药渣分别加入6倍量70%乙醇闪提1次，每次1min，每个试验组平行做3份，以桃仁中苦杏仁苷的含有量及转移率为指标，结果见表2。

表2 提取电压的考察（x±s，n=3）

由表2可见，苦杏仁苷转移率最高时的电压为120 V，因此，选用120 V为闪式提取的有效电压。

2.2.2 苦杏仁苷的闪式提取正交试验选取乙醇体积分数（A）、料液比（B）和提取时间（C）为考察因素，以提取物中苦杏仁苷的含有量和转移率为考察指标，选择水平进行正交试验。选桃仁药材，粉碎，称取50 g，用石油醚（沸程30～60℃）回流1 h，在120 V电压下按L9（34）正交表，分别闪式提取2次，合并滤液，回收乙醇，将滤液浓缩至浸膏，后冷冻干燥，得粗提物。取本品粗提物约10 mg，精密称定，精密加入甲醇5 mL，使完全溶解，过滤，精密量取续滤液1mL，置10mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按 “2.1.1”项下色谱条件进样，结果见表3～5。

表3 因素水平

表4 苦杏仁苷闪式提取工艺正交试验设计与结果

表5 方差分析

结果分析：由表3可知，三个因素的影响大小顺序是乙醇体积分数＞料液比＞提取时间，在表4中可知，A因素对苦杏仁苷的含有量和转移率有极显著的影响（PA＜0.01），且A2＞A3＞A1，故选A2；而因素B和因素C对苦杏仁苷的含有量和转移率无显著影响，根据表3的测定结果显示，苦杏仁苷的闪提最佳工艺是A2B2C1，即加10倍70%乙醇闪式提取1min。

2.2.3 验证试验为验证正交设计实验中最优工艺的重复性和可靠性，分别取50 g桃仁，用闪提最优工艺进行提取，平行操作3份，药材中苦杏仁苷的含有量分别为2.50、2.49、2.50mg/g，可见其工艺稳定性和重复性良好。

2.2.4 闪提与乙醇回流提取法对比［9-10］设计出乙醇回流提取苦杏仁苷的最优工艺：70%乙醇回流提取2次，每次30 min，料液比是1∶12（g∶mL），结果比较见表6。

从表6可知，闪式提取法所用的时间比回流提取法所用的时间短，且闪式提取苦杏仁苷的转移率高于回流提取的转移率，故闪式提取法优于传统的回流提取法。

3 桃仁多糖的提取

3.1 提取工艺［11-12］分别取闪式提取与回流提取后的药渣，用药渣质量30倍量体积的蒸馏水80℃水浴提取多糖两次，合并滤液，将滤液浓缩至料液比1∶1.5～1∶2（原料重：溶液体积），加入乙醇使醇体积分数为80%（V/V）进行醇沉，在4℃冰箱中静置12 h，醇沉液离心，下层沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，即得桃仁多糖粗提物。

表6 闪式提取和回流提取的工艺比较（x±s，n=3）

3.2 多糖的测定

3.2.1 多糖标准曲线的测定精密称定干燥至恒定质量的无水葡萄糖对照品33.36mg，加至100mL的量瓶中，加水溶解并定容至刻度作为对照品溶液；精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于具塞试管中，加水补足2mL，各精密加入5%苯酚试液1 mL，摇匀，迅速加入硫酸5 mL，摇匀放置10 min，置40℃水浴中保温15 min，取出，迅速冷却至室温［1］，以相应的试剂做空白，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，显色时多糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线：Y=61.103X-0.081 7，r=0.999 0，结果表明多糖在0.066 72～0.333 6 mg/mL范围内线性关系良好。

3.2.2 样品的测定称取样品多糖2 mg，蒸馏水溶解于25mL量瓶中定容摇匀，精密吸取2 mL溶液于具塞试管中，空白对照以蒸馏水代替糖溶液，分别加5%苯酚溶液1 mL，再加浓硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，置40℃水浴中保温15 min，取出迅速冷却到室温，在波长490 nm处测定吸光度，代入标准曲线计算多糖含有量，结果见表7。

表7 药渣提取多糖的结果比较（x±s，n=3）

结果分析：闪式提取法提取苦杏仁苷后的药渣提取多糖，多糖的出膏率高于回流提取法提取后药渣中多糖的出膏率，可见闪式提取法将药材粉碎更有利于多糖的提取。

4 讨论

4.1 苦杏仁苷提取工艺的比较通过正交试验对闪式提取桃仁中苦杏仁苷工艺的优化，即12倍量70%的乙醇闪式提取1 min，与乙醇回流对比，结果显示闪式提取对药材有效成分的提取率高，提取时间短，提取效率高，其绿色、环保、高效、经济等方面的优势是传统回流法不能比拟的。4.2 多糖结果分析从回流提取法提取多糖的结果分析，闪式提取苦杏仁苷后的药渣提取多糖，多糖的出膏率高于回流提取后药渣提取多糖的出膏率，原因是在闪式提取过程中药材粒径更小，从而更有利于有效成分在提取过程中的析出。

闪式提取器的主要原理是在植物组织破坏提取法的基础上，利用高速机械外力迅速破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的有效成分与溶剂充分接触，从而实现有效成分的快速提出［13-14］。通过本实验可以看出，闪式提取相对传统的回流提取具有提取率高，节省时间，操作简便的特点。然而闪式提取在提取药材的过程中，药材粉碎过细，易出现不易抽滤的现象；并且闪式提取操作时间不能太长，单次不能超过2min。因该方法是室温提取，具有不易破坏有效成分的特点，因此适应于多种有效成分的提取，并且高效节能，是一种有发展潜力的新型提取技术。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：232-233.

［2］于兆霞，陈正爱，钟秀宏，等.桃仁乙醇提取物对亚急性衰老大鼠的抗衰老作用［J］.中国老年学杂志，2013，33（11）：2607-2608.

［3］以敏，邓家刚，郝二伟，等.桃仁提取物对不同病因所致大鼠血液循环障碍的影响［J］.中草药，2013，44（7）：858-862.

［4］李杨，董银卯，孟宏，等.7种中草药提取物抗过敏功效及刺激性研究［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（4）：191-194.

［5］裴瑾，颜永刚，万德光，等.桃仁油对动物血液流变学及微循环的影响［J］.中成药，2011，33（4）：587-589.

［6］许宁侠，陈邦，申烨华，等.响应面法优化长柄扁桃中苦杏仁苷的提取工艺［J］.食品工业科技，2014，35（4）：270-273.

［7］史双枝，刘忆冬，李疆，等.水酶法同时提取核桃仁油脂及水解蛋白的工艺研究［J］.中国食品添加剂，2010，15（1）：131-135.

［8］刘云，刘通讯.桃仁油的超声波辅助提取及脂肪酸组成分析［J］.食品工业科技，2010，25（2）：292-294，313.

［9］陈志红，王莉平，李敏，等.核桃仁中苦杏仁苷提取工艺的研究［J］.应用化工，2010，39（7）：949-951.

［10］邓康颖，谭晓梅，罗佳波.一种苦杏仁苷提取物的制备方法［J］.中华中医药学刊，2010，28（10）：2172-2174.

［11］王亮，姜波，王喜春，等.桃仁中多糖的提取工艺研究［J］.时珍国医国药，2009，20（2）：271-272.

［12］谢霞，李芝，黄玮超，等.细柱五加茎多糖闪式提取工艺优化及其免疫活性研究［J］.中草药，2013，44（20）：2859-2863.