炮制对巴戟天中蒽醌类成分的影响

李 倩， 朱水娣， 刘 硕， 马务迢， 刘伟贤， 丁 平*

（1.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；2.广州中医药大学门诊部，广东 广州 510006；3.无限极 （中国）有限公司，广东广州510665）

［饮片炮制］

炮制对巴戟天中蒽醌类成分的影响

李 倩1， 朱水娣2， 刘 硕3， 马务迢3， 刘伟贤3， 丁 平1*

（1.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；2.广州中医药大学门诊部，广东 广州 510006；3.无限极 （中国）有限公司，广东广州510665）

目的研究巴戟天的3种炮制品 （巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天）在炮制过程中蒽醌类化学成分的变化。方法应用HPLC检测技术，以甲基异茜草素-1-甲醚及总蒽醌类化学成分为评价指标，分别考察3种炮制品在不同蒸制时间、加盐量及盐蒸时间、甘草量及煎煮时间条件下蒽醌类化学成分的变化。结果甲基异茜草素-1-甲醚在加热和加入辅料盐后均有增溶现象，但随着时间的延长，其含有量逐渐下降；在加入辅料甘草后该成分明显下降。总蒽醌类化学成分在不同炮制过程中随着加热时间的增加和辅料盐、甘草的加入，其变化均为先上升后下降。结论控制巴戟天炮制时间和辅料用量有助于控制巴戟天炮制品的质量。

巴戟天；蒽醌；甲基异茜草素-1-甲醚；炮制

巴戟天来源于茜草科巴戟天属植物Morinda officinalis How的干燥根，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效［1］，是著名的 “四大南药”之一。巴戟天含有蒽醌、寡糖、多糖、环烯醚萜等化学成分。现代药理研究表明，蒽醌类化学成分具有抗菌、降压、降脂、抗癌、抗骨质疏松等作用［2］，是巴戟天的主要活性成分之一。临床用巴戟天多以炮制品为主，主要为巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天。炮制会使巴戟天中多种化学成分发生变化［3-6］，中药炮制后化学成分及物质基础的变化是中药炮制前后性味、功能改变的重要原因，阐明炮制过程中化学成分的变化是中药炮制机理研究的主要内容［7］。目前，关于多种中药化学成分在炮制过程中变化规律的研究较多［8-10］，但对炮制过程中巴戟天蒽醌类化学成分变化的研究还不够全面。为此，本研究结合相关炮制方法［11-14］，利用高效液相色谱技术 （HPLC）对巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天在炮制过程中蒽醌类化学成分的变化进行系统地研究，从而为巴戟天炮制方法的制定提供科学依据。

1 仪器与材料

Waters 2695 Separations Module高效液相色谱仪（美国Waters公司）；CHROMAP1.5色谱指纹图谱分析系统解决方案 （珠海科曼中药研究有限公司）；Sartorius BS124S分析天平（北京赛多利斯仪器设备有限公司）；数显恒温水浴锅；电热恒温鼓风干燥箱 （上海一恒科学仪器有限公司）。

巴戟天药材来源于德庆县高良镇，经广州中医药大学丁平研究员鉴定为巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。凭证标本保存于广州中医药大学中药资源研究室。甲基异茜草素-1-甲醚对照品为自制品 （HPLC检测，纯度＞98%）。乙腈、甲醇（色谱纯，美国Spectrum公司），磷酸 （色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），三氯甲烷为分析纯，水为去离子水。

2 方法

2.1 巴戟天不同炮制品的制备 巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天参照 《中国药典》［1］并结合表1中条件制备。各炮制品平行制备2份，粉碎，过60目筛。

表1 巴戟天各炮制品制备工艺考察Tab.1 Factors of processing of processed Morindae officinalis Radix

2.2 色谱条件 色谱柱DiamonsilTMC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液 （B），梯度洗脱 （0～5 min，20%A；5～10 min，20%～44%A；10～40 min，44%A；40～50 min，44%～95%A；50～55 min，95%A）。体积流量1.0 mL/min；进样量20μL；检测波长277 nm；柱温30℃。

2.3 对照品溶液制备 取甲基异茜草素-1-甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.4 供试品溶液的制备 取巴戟天粉末 （过60目筛）5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入三氯甲烷100 mL，于80℃加热回流提取2次，每次2 h。滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，连续进样6次，测定指纹图谱。以甲基异茜草素-1-甲醚为参照峰，所得共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，同时用相似度评价软件计算，各指纹图谱相似度达0.99以上，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 精密称取同一批药材粉末6份，按照 “2.4”项方法平行制备供试品溶液，分别进样，测定指纹图谱，所得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，各指纹图谱相似度达0.95以上，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在0、2.5、5、10、24、48 h进样6次，测定指纹图谱，所得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，各指纹图谱相似度达0.99以上，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.6 样品测定 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪测定，记录55 min的色谱图，计算各共有峰的峰面积。

2.7 巴戟天蒽醌类化学成分指纹图谱共有模式的建立 收集10批巴戟天规范化种植基地的样品，以 “2.4”项供试品溶液制备方法处理，按照“2.2”项色谱条件测定，将得到的HPLC图使用“指纹图谱相似度评价系统 （chromap 1.5）”软件分析，选取参照图谱，利用中位数法进行多点校正自动匹配后生成巴戟天蒽醌类化学成分指纹图谱共有模式 （图1），并构建巴戟天蒽醌类化学成分HPLC指纹图谱 （图2）。与对照品对比表明，12号峰为甲基异茜草素-1-甲醚 （S），计算各指纹峰的相对保留时间，以峰出现率100%计，共标定23个共有峰 （其峰面积总和计为总蒽醌）。10批样品相似度在0.97～0.99之间。

图1 巴戟天蒽醌类化学成分HPLC指纹图谱共有模式Fig.1 HPLC fingerprint common pattern of anthraquinones from Morindae officinalis Radix

图2 10批巴戟天蒽醌类化学成分HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprin ts of anthraquinones from 10 batches of Morindae officinalis Radix

3 结果

3.1 巴戟肉在炮制过程中蒽醌类化学成分的变化规律 巴戟肉在不同时间 （20～240 min）蒸制时，随蒸制时间的增加，甲基异茜草素-1-甲醚在20 min升至最高，然后缓慢下降，90 min后低于生巴戟天；总蒽醌类化学成分在60 min时达到最高，然后逐渐下降 （图3）。由于巴戟天在蒸制60 min时较易去心，符合 《中国药典》［1］蒸法的要求，因此，炮制巴戟肉时，蒸制时间以60 min为宜。

3.2 盐巴戟天在炮制过程中蒽醌类化学成分的变化规律 考察不同加盐量 （1%～8%）对盐巴戟天中蒽醌类化学成分的影响，结果发现：甲基异茜草素-1-甲醚及总蒽醌类化学成分随加盐量的增加均呈先上升后下降的趋势，在3%时最高 （图4），故以3%作为盐巴戟天最佳加盐量。

图3 巴戟肉在不同蒸制时间条件下蒽醌类化学成分峰面积变化曲线Fig.3 Curves of anthraquinones'peak area of Morindae officinalis Radix steamed at differen t tim e

以3%加盐量炮制盐巴戟天时，考察其在不同时间 （20～240 min）盐蒸时蒽醌的变化规律，结果显示：随盐蒸时间的增加，甲基异茜草素-1-甲醚在20 min升至最高，然后缓慢下降，60 min后低于生巴戟天；总蒽醌类化学成分在60 min时达到最高，然后逐渐下降 （图5）。因此，以3% 加盐量炮制盐巴戟天时，盐蒸时间以60 min为宜。

图4 盐巴戟天在不同盐浓度条件时蒽醌类化学成分峰面积变化曲线Fig.4 Curves of anthraquinones'peak area of Morindae officinalis Radix at the condition of different salt concentrations

图5 3%盐巴戟天在不同盐蒸时间条件下蒽醌类化学成分峰面积变化曲线Fig.5 Curves of anthraquinones'peak area of 3% Morindae officinalis Radix salted at d ifferent time

3.3 制巴戟天在炮制过程中蒽醌类化学成分的变化规律 根据 《中国药典》［1］和文献［15］记载，考察甘草用量4%～10%对制巴戟天中蒽醌类化学成分的影响，实验结果表明：甘草制巴戟天HPLC指纹图谱在10.70 min（X1）、14.40 min（X2）、20.52 min（X3）、47.48 min（X4）、48.38 min（X5）、50.13 min（X6）处出现新的色谱峰 （图6中箭头所示），其中X2色谱峰面积最大，且随甘草用量增加而明显递增，经与甘草生药材HPLC指纹图谱对比发现，X1、X2、X4、X5、X6与甘草中的化学成分一致，说明以上成分为制巴戟天在炮制过程中引入甘草而产生的，而X3有待进一步探讨。在此过程中，甲基异茜草素-1-甲醚明显下降；总蒽醌类化学成分呈上升趋势，在甘草用量为8%时达到最高，然后近于平稳 （图7）。综合以上因素，以8%作为制巴戟天中甘草的最佳用量。

以甘草用量8%炮制制巴戟天时，考察其在不同时间 （20～120 min）煎煮时蒽醌的变化规律，结果表明：随煎煮时间的增加，甲基异茜草素-1-甲醚逐渐下降，总蒽醌类化学成分在30 min时达到最高，然后逐渐下降 （图8）。因此，以甘草用量8%炮制巴戟天时，煎煮时间以30 min为宜。

图6 制巴戟天与生巴戟天蒽醌类化学成分HPLC指纹图谱对比Fig.6 Difference of HPLC chrom atogram s between raw and licorice-processed Morindae officinalis Radix

3.4 巴戟天炮制方法制定 根据上述变化规律，制定巴戟天各炮制品的炮制方法，即：巴戟肉以生巴戟天加水闷润3.5 h至透心，文火蒸60 min；盐巴戟天为每100 g生巴戟天加入3% 的食盐水50 m L，闷润3.5 h，文火蒸60 min；制巴戟天为每100 g生巴戟天加入8%的甘草汁250 mL，闷润30 min，文火煎煮30min至甘草汁被吸尽。炮制后均趁热除去木心，干燥。

图7 制巴戟天在加不同甘草量时蒽醌类化学成分峰面积变化曲线Fig.7 Curves of anthraquinones'peak area of Morindae officinalis Radix at add ing different licorice

图8 8%甘草制巴戟天在不同煎煮时间条件下蒽醌类化学成分峰面积变化曲线Fig.8 Curves of anthraquinones'peak area of 8%Morindae officinalis Radix decocted at different tim e

3.5 验证试验 以 “3.4”方法炮制巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天各3批进行验证试验，结果表明，甲基异茜草素-1-甲醚的变化规律为盐巴戟天＞巴戟肉＞生巴戟天＞制巴戟天，总蒽醌的变化规律为盐巴戟天＞制巴戟天＞巴戟肉＞生巴戟天（图9），与上述研究结果一致。

图9 巴戟天各炮制品中蒽醌类化学成分的比较Fig.9 Com parison of anthraquinones from processed Morindae officinalis Radix

4 讨论

4.1 巴戟天在应用不同方法炮制的过程中，甲基异茜草素-1-甲醚在加热和加入辅料盐后，都出现增溶现象使其含有量升高，这与中药在炮制中加热及加入辅料可增溶、助溶或起协同作用而增效的目的一致［16］，但随着时间的延长，其含有量逐渐下降，可能为蒽醌在长时间湿热条件下不稳定、发生降解所引起［17］。因此，科学合理地优化最佳炮制时间尤其重要。而在制巴戟天的炮制过程中，由于甘草的加入，甲基异茜草素-1-甲醚明显下降，与文献［18］报道甘草与大黄共煎时大黄素甲醚含有量下降的结果相似，是否是与甘草中三萜皂苷或其他成分发生作用，有待进一步深入研究。

4.2 巴戟天中总蒽醌类化学成分在不同炮制过程中随加热时间的延长、辅料盐和甘草的加入，变化规律为先上升后下降，说明适当的加热、辅料盐、甘草［19］对总蒽醌类化学成分均有助溶作用，而长时间的加热则可能使蒽醌类成分发生降解。

经本研究优化的方法炮制后，巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天中总蒽醌含有量均高于生巴戟天，与文献［6，20］报道结果一致。

4.3 甘草制巴戟天中出现了6个新色谱峰，其中5个与甘草中的成分一致，另外1个未知，该未知成分的产生是否为甘草中的三萜皂苷、黄酮类成分对蒽醌的作用，仍需进一步探讨。

4.4 目前以蒽醌类成分评价巴戟天炮制品质量的研究多为各炮制品HPLC指纹图谱或成分含有量的比较［21-22］，而现有炮制方法并未指明炮制时间或明确的炮制终点，造成巴戟天炮制品质量存在差异。本研究考察了炮制过程中炮制时间和辅料对巴戟天蒽醌类化学成分的影响，揭示了该类成分在炮制过程中的变化，提出了各炮制品详细的炮制方法，为有效控制巴戟天炮制品的质量提供科学依据。

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Changes of anthraquinones from processed Morindae officinalis Radix

LIQian1， ZHU Shui-di2， LIU Shuo3， MA Wu-tiao3， LIUWei-xian3， DING Ping1
（1.College of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.Clinic of Guangzhou University of ChineseMedicine，Guangzhou 510006，China；3.Infinitus（China）Company Limited，Guangzhou 510665，China）

AIMTo investigate the changes of anthraquinones from three kinds of processed Bajitian（Morindae officinalis Radix），including steaming-，salt-steaming-，and licorice-boiling Bajitian.METHODSRubiadin-1-methyl ether and total anthraquinones contentwere selected as quality index by HPLC to analyze the changes under the conditions of the steaming time，the salt consumption，salt-steaming time，the licorice consumption and decoction time.RESULTSThe solubilization for rubiadin-1-methyl ether was found in the heating process and the addition of salt，but their contentgradually decreased as the heating time extended.Butadding licorice reduced rubiadin-1-methyl ether content.With the heating time extended and the addition of excipients，the peak area of total anthraquinones increased and then decreased.CONCLUSIONControlling the processing time plays a key role in the control of processed products of Bajitian.

Bajitian（Morindae officinalis Radix）；anthraquinone；rubiadin-1-methyl ether；processing

R283

：A

：1001-1528（2015）06-1284-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.027

2014-10-08

巴戟天盐炙品指纹图谱 （蒽醌）研究 （PPD/11/07/014）；广东省自然科学基金重点项目 （06105061）

李 倩 （1990—），女，硕士生，研究方向为中药资源有效成分与质量评价。Tel：15521302860，E-mail：liqian0080@ 126.com

*通信作者：丁 平 （1965—），女，博士，研究员，研究方向为中药资源有效成分与质量评价。Tel：（020）39358080，E-mail：dingpinggz@126.com