苦菜总黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的保护作用

刘仰斌，张志花，陈亚运

(赣南医学院，江西 赣州 341000)

血脑屏障由毛细血管内皮细胞、细胞间紧密连接、基底膜以及星形胶质细胞三种结构组成。它们可以阻止血液中的某些物质向中枢转运，从而保证中枢神经系统内环境的稳定。脑缺血及再灌注时，由于缺血后大量的氧自由基产生，造成对脑血管的损伤，导致血管内皮水肿、胶质细胞肿胀、基底膜损害、细胞间连接解离，破坏了血脑屏障的功能，脑微循环出现障碍，最终导致脑血管疾病的发生。

苦菜是一种食药两用的植物，药理研究证实，苦菜具有较强的抗氧自由基、改善血液系统、抗血小板聚集、抗血栓形成、降低血脂等作用。［1－6］为进一步研究苦菜的药理作用，特别是其在心脑血管方面的作用，笔者应用大鼠MCAO(Middle cerebral artery occlusion)再灌注损伤模型，模拟临床脑卒中(又称中风)的症状，观察苦菜总黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障结构及通透性的影响。以期为苦菜在临床上的应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 苦菜总黄酮按照刘仰斌等［1］建立的方法先配制好，浓缩成2.5g/mL 的溶液，并储存于冰箱中以备实验需要;伊文思蓝 (Evans blue，EB)染料(上海恒远生物科技有限公司)，4%多聚甲醛(上海谱振生物科技有限公司)，其他试剂均为市售分析纯。

1.2 主要仪器设备 Gemini XPS 荧光酶标仪(美谷分子仪器上海有限公司);FA2004 电子称(上海光学仪器厂);超速低温离心机(美国贝克曼库尔特有限公司);H－9500 透射电子显微镜(日立高新技术上海国际贸易有限公司);手动匀浆机(江苏金坛环宇科学仪器厂);高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies 公司);紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司);不锈钢动物解剖台(上海标普公司);大鼠尼龙线栓(北京沙东生物技术有限公司)。

1.3 动物分组 SPF 级SD 大鼠30 只，自由饮食，均为雄性，体质量(230 ±20)g，由赣南医学院实验动物中心提供，许可证号为SYXK (赣)2007－0002。根据实验动物使用的3R 原则，所有SD 大鼠在实验前均给予人道的关怀，实验前适应性饲养1周。实验时30 只SD 大鼠随机分为5 组(每组6只):假手术组、MCAO 再灌注模型组、MCAO 再灌注模型+苦菜总黄酮25.0mg/kg 组、50.0mg/kg 组、100.0mg/kg 组。苦菜总黄酮处理组大鼠于MCAO 手术后30min，10h，20h 尾静脉注射给药3 次;假手术组及MCAO 再灌注模型组大鼠于同时间点给予同体积的生理盐水尾静脉注射。

1.4 方法

1.4.1 MCAO 再灌注损伤模型的建立 参照Longa等［7］建立的方法制备好MCAO 模型，缺血2h 后进行再灌注，制成缺血再灌注模型。假手术组大鼠只暴露和分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不闭塞大脑中动脉。术中室温严格控制在24℃－26℃。

1.4.2 大鼠血脑屏障通透性的测定 血脑屏障通透性采用脑组织中EB 含量来表示。大鼠处死前30min 尾静脉注射EB 液0.25mL (0.5%，溶于生理盐水)，直至四肢与尾部的黏膜变蓝色为止。再灌注24h 后，麻醉各组大鼠，先用生理盐水对大鼠进行心脏灌流，然后处死断头取脑，取缺血侧前脑，称重后，用7.5% 三氯乙酸匀浆 (3mL/g)。取一份匀浆液于12000g，4℃，离心20min，取上清液于620nm 处测定吸光度，以EB 系列浓度溶液制作标准曲线，进行EB 定量。结果以μg/g (脑湿重)表示EB 含量。

1.4.3 大鼠血脑屏障超微结构的电镜观察 上述方法取缺血侧前脑后，余下大脑常规4%多聚甲醛内固定，取缺血侧顶叶皮质脑组织修成lmm ×lmm×lmm 小块，2%多聚甲醛－戊二醛固定2h，1%锇酸4℃固定2h，梯度乙醇脱水，环氧丙烷置换，纯树脂包埋，聚合，修块后半薄切片，天青－美蓝染色，光镜下定位，超薄切片醋酸双氧铀、枸椽酸铅染色，透射电子显微镜下观察。

1.5 数据分析 采用SPSS 19.0 软件对数据进行分析，实验结果均以± S 表示，组间比较采用单因素(one－way ANOVA)方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦菜总黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中EB 含量的影响 见表1。MCAO 模型组大鼠由于血脑屏障通透性增强，导致脑组织EB 含量显著升高，与假手术相比具有显著性差异(P ＜0.01)，苦菜总黄酮各剂量组可显著降低脑组织中的EB 含量，与模型组相比有显著性差异 (P ＜0.05 in 25.0mg/kg;P ＜0.01 in 50.0mg/kg 和100.0mg/kg组)，提示苦菜总黄酮能够减轻由于MCAO 造成的脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性的改变，减少EB 的渗漏。

表1 苦菜总黄酮对大鼠脑组织中EB 含量的影响

2.2 苦菜总黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障超微结构的影响 见图1。假手术组血脑屏障结构完整，表现为血管内皮细胞结构完整，血管周围胶质细胞足突和周细胞无明显肿胀发生，血管壁结构完整，管腔未受挤压。模型组血管周围有大量肿胀的胶质细胞，表现为胞质内空泡形成，大量水肿液。血管周围足突肿胀，与基膜分离，肿胀的星形胶质细胞和周细胞压迫血管，造成血管官腔变窄，引发血流障碍。给予苦菜总黄酮可显著改善MCAO引发的脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障损伤。在25.0mg/kg 组，血脑屏障的星形胶质细胞水肿程度明显减轻，虽然周细胞仍存在肿胀现象，但与模型组相比，血管官腔明显恢复，提示血流明显恢复。当剂量提升至50.0mg/kg 和高剂量组100.0mg/kg时，血脑屏障结构中周细胞肿胀得到显著抑制，周围星形胶质细胞水肿亦得到显著减轻，提示苦菜总黄酮对MCAO 引发的脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障损伤具有显著的改善作用。

图1 苦菜总黄酮对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障超微结构的影响

3 讨论

血脑屏障的主要结构为血管内皮细胞、基底膜及星形胶质细胞，三种结构可以阻止血液中的某些物质向中枢转运，对中枢神经系统内环境的稳定起着重要作用。脑缺血缺氧后，脑内通过各种途径和机制产生大量氧自由基，在再灌注时期由于之前抗氧化酶已经大量消耗，自由基积累更为明显，大量自由基进而引发生物膜发生脂质过氧化反应，破坏了膜结构的完整性，膜的通透性增加，最终导致血脑屏障功能受损，脑组织超微结构发生变化，大分子物质可进入脑组织间隙，引发脑水肿，［8，9］脑水肿又可加重脑缺血缺氧状态，二者产生恶性循环，加剧了脑组织和脑细胞的损伤。因此，保护膜结构的完整性，恢复血脑屏障功能，是临床诊疗的方向之一。

作为一种民间食药两用的植物，在民间苦菜常用于清热、解毒、凉血等。现代药理研究［1－5］也证实，苦菜有改善造血系统、抗血栓形成、抗氧化、降血脂等功效。在前期的研究［1，2］中，发现苦菜总黄酮可提高抗氧化物酶的活性，促进自由基的清除，进而抑制氧化应激，能有效保护离体缺血再灌注损伤心肌。另外，苦菜总黄酮能改善血液系统、抗血小板聚集、降低血液粘稠作用，其也可以通过这些途径改善脑血管缺血缺氧状态，从而保护脑组织和脑细胞。

总之，苦菜总黄酮可显著减轻缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的破坏程度，降低血脑屏障的通透性，减轻脑水肿，具有重要的脑保护作用。另外，发现在3 个剂量的苦菜总黄酮当中，高剂量苦菜总黄酮组中的各指标更接近假手术组，显示高剂量的苦菜总黄酮对血脑屏障的保护作用更好，说明苦菜总黄酮对血脑屏障的保护作用与其量效有一定关系。对于这个发现，有待于进一步的研究和开发。

［1］刘仰斌，李启华，刘欣. 苦菜总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］. 郑州大学学报(医学版)，2010，45(1):107－110.

［2］刘仰斌，刘欣，李启华，等. 苦菜水提取物对大鼠抗氧化作用的实验研究［J］. 宜春学院学报，2010，32(8):50－51.

［3］卢新华，罗金荣，王俊杰，等. 苦菜提取物抗凝血作用实验研究［J］. 实用中医药杂志，2007，23(1):71－72.

［4］刘仰斌，徐燕，陈学洪，等. 苦菜水提取物对力竭运动训练大鼠血脂和血液生化指标的实验研究［J］. 宜春学院学报，2011，33(4):72－74.

［5］刘仰斌，张志花. 苦菜总黄酮对高脂血症家兔动脉粥样硬化影响的实验研究［J］. 湘南学院学报(医学版)，2012，14(2):1－3.

［6］刘仰斌，张志花，周建荣，等. 苦菜总黄酮对离体缺血再灌注损伤心肌生化指标的影响［J］. 齐齐哈尔医学院学报，2014，35(16):2352－2354.

［7］Longa EZ，Weinstein PR，Carlsons，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84－91.

［8］张字玲，蔡文杰. 脑缺血再灌注动物模型的血脑屏障损伤［J］. 中国组织工程研究，2012，16(15):2848－2850.

［9］董小平，喻斌，金路，等. 血脑屏障细胞组成研究进展［J］. 中国实验方剂学杂志，2012，18(8):281－284.