碱性嫩黄O 分子印迹聚合物的固相萃取性能研究

张峻菁，杨守仁

(1. 清远市食品药品检验所，广东 清远 511515;2. 清远职业技术学院，广东 清远 511500)

碱性嫩黄O(Auramine O)又称碱性槐黄、奥拉明O、金胺O 等，黄色粉状物，溶于冷水、易溶于热水及乙醇，溶液呈亮黄色。其化学结构式如图1。［1］

图1 碱性嫩黄O(Auramine O)的化学结构式

碱性嫩黄O 为芳香胺类工业染料，主要用于皮革、棉麻、纸、草编织品等的染色，亦用于印染棉织品，其色淀用于制墙纸、色纸、油墨和油漆等。为改善食品外观，碱性嫩黄O 常被不法生产者添加在腐竹、腐皮、豆制品等食品中，以牟取非法利益，长期摄入会致癌、致畸、致突变性，严重危害人体健康。卫生部《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第一批)》中碱性嫩黄O 被列为非食用物质，欧盟亦不允许使用。［2］

目前中国暂没有碱性嫩黄O 的标准分析方法。其检测方法主要有高效液相色谱法、［3，4］高效液相色谱－串联质谱法、［5－7］毛细管电泳法［7］等。由于碱性嫩黄O 在食品中一般只需要微量添加，给前处理和检测都造成一定困难，因此，建立一种准确、可靠、简便的前处理方法在食品安全领域有着重要的实际应用价值。

本实验合成了一种对碱性嫩黄O 具有特异识别性能的分子印迹聚合物，用该聚合物制作的固相萃取小柱在萃取过程中能同时实现分离和富集，［8－10］在简化仪器分析前处理的同时提高准确度。结果显示该小柱萃取性能优良，可望应用于食品、日化品中非法添加碱性嫩黄O 的检测。

1 仪器与试药

碱性嫩黄O (上海晶纯生化科技股份有限公司，AR);丙烯酰胺(AM，成都市科龙化学试剂厂);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，上海晶纯生化科技股份有限公司，AR);偶氮二异丁腈(AIBN，天津市科密欧化学试剂有限公司);甲醇(Merk，HPLC);甲醇、乙腈、乙酸、氨水(广州市化学试剂厂，AR)。

紫外可见分光光度计(UV－1750，岛津公司);固相萃取小柱及筛板(深圳逗点生物科技有限公司);SC－8L－150 数控固相萃取仪(广州市智真生物科技有限公司);HH－6 型恒温水浴锅(金坛市宏华仪器厂);恒温振荡仪(金坛市富华仪器公司);RP－HPLC 高效液相色谱仪(岛津，LC－10Ap plus，UV检测器，LcSolution 色谱工作站)。

2 方法

2.1 聚合物的制备

称取0.2g (约0.7mmol)碱性嫩黄O 置于250ml 的圆底烧瓶中，加入80ml 乙腈及20ml 甲醇溶解，加入丙烯酰胺(AM)0.1g (约1.5mmol)振荡2h，以使AM 和碱性嫩黄O 充分作用，然后再加入二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)2ml (约10mmol)、30mg 偶氮异丁腈(AIBN)，超声振荡混匀后，通N2除氧15min 后密闭，置于65℃恒温水浴中反应24h，得到淡黄色聚合物。

将聚合物倒出，用滤纸过滤后包好后放入索氏提取器，用甲醇－氨水(V:V =85:15)洗脱碱性嫩黄O，直至洗脱液干净，取出聚合物置于烘箱80℃下烘干，置干燥器保存。

空白聚合物的制备步骤相同，但是不用添加模板分子。

2.2 络合量的测定

2.2.1 标准曲线 称取碱性嫩黄O 0.1519g，用甲醇溶解、定容于500ml 的容量瓶中，得浓度为1.000mmol·L－1的母液，备用。吸取适量母液稀释成浓度为0.01000 ～0.06000mmol·L－1的6 个标准溶液梯度系列。在431.5nm 波长下测定该系列标液的吸光度值A，以A 为纵坐标、浓度C (mmol·L－1)为横坐标作图，即得碱性嫩黄O 标准曲线。

2.2.2 络合量Q 的测定 称取模板聚合物:每份30mg，共10 份，分别置于50mL 具塞锥形瓶中;在个锥形瓶分别加入20ml 不同浓度的碱性嫩黄O标准溶液。置于振荡器上振荡24h;静置澄清后，用一次性针筒吸取上层清液，用0.45u 滤膜过滤，取滤液直接(或根据需要稀释后)用紫外分光光度法测量吸光度;根据标液被吸附前后吸光度的变化来计算模板聚合物的吸附量。

用相同方法测量空白聚合物的吸附量。

2.3 固相萃取实验

2.3.1 固相萃取小柱的制作 分别称取模板聚合物和空白聚合物各0.5g，以蒸馏水为匀浆剂，湿法装入直径8mm 的固相萃取小柱中，压紧上筛板;用甲醇反复冲洗，制得碱性嫩黄O 分子印迹聚合物与非印迹聚合物固相萃取小柱。

2.3.2 固相萃取及洗脱 配制0.07mmol·L－1的碱性嫩黄O 标准溶液，取5ml 上样，设定萃取时间，收集过柱液，用紫外法测定过柱液的吸光度，计算萃取率。

分别用甲醇－乙酸(V:V=85:15)、甲醇－氨水(V:V=85:15)12.5mL 洗脱，设定洗脱时间，收集洗脱液;直接或根据需要稀释后用紫外法测定洗脱液吸光度，计算洗脱率。

2.4 HPLC 方法及样品测定

2.4.1 色谱条件 C18柱(250mm×4.6mm，5μm，迪马公司)，进样量20μL，流动相甲醇－1%氨水(60∶40)，流速0.8mL·min－1，紫外检测波长431.5nm。

2.4.2 市售腐竹样品前处理及测定 取10g 普通市售腐竹，研磨粉碎后转移至离心管中，加入20ml 乙醇及5g 无水硫酸钠，超声15min，离心，上层清液过MIP 或NMIP 小柱，收集洗脱液过0.22um 膜，吸取滤液0.5mL 稀释至10mL。按“2.4.1”项下方法测量碱性嫩黄O 的峰面积。

3 结果与讨论

3.1 聚合物的合成 通常模板分子、功能单体、交联剂的比例为1:4:20，本实验经比较研究采用的比例为0.7:1.5:10，得到的模板聚合物具有较好的选择性和识别能力。

3.2 标准曲线 按2.2.1 项所述方法测定碱性嫩黄O 标准溶液的吸光度A，得到回归方程为:A =29.60C+0.01 (r=0.9999)，表明溶液在0.01000 ～0.06000mmol·L－1的浓度范围内具有良好的线性关系。

3.3 络合量的测定 按2.2.2 项所述方法，测定吸附前后底物浓度变化，吸附量的计算公式为Q=(C0－C) (V ×10－3)·M·1000/30 (C0为吸附前标准溶液的起始浓度、C 为吸附后溶液浓度、V为加入标准溶液的体积、M 为碱性嫩黄O 的分子量，Q 的单位为mg·g－1)。

表1 碱性嫩黄O 模板、空白聚合物的吸附量

图2 MIP、NMIP 吸附量对比图

从表1 及图2 可看出，碱性嫩黄O 模板聚合物和空白聚合物的吸附量总趋势是随模板分子溶液的浓度增大而增大;不同的底物浓度，特别是在较高浓度下，模板聚合物比空白聚合物的吸附能力增强;模板聚合物的吸附量随模板分子浓度的增大而逐渐呈现饱和趋势，而空白聚合物呈现线性增加的趋势，因此可认为模板聚合物对碱性嫩黄O 具有特异性识别的性能。

3.4 固相萃取实验结果

3.4.1 萃取率 按2.3.1 项所述方法制作固相萃取小柱并进行萃取实验，结果见表2。模板柱的一次性萃取率高达95.86%，明显高于空白柱，说明模板柱为特异性吸附起主要作用，而空白柱为非特异性吸附起主要作用，呈现了较好的选择性。

表2 模板、空白聚合物对碱性嫩黄O 的固相萃取结果

3.4.2 洗脱剂比较 按2.3.2 项所述方法洗脱被萃取的碱性嫩黄O。用甲醇－氨水(V:V=85:15)洗脱的效果较好，洗脱率平均在95%以上，用醇－乙酸(V:V=85:15)的洗脱率接近80%，因此采用甲醇－氨水(V:V=85:15)作为洗脱剂。

3.5 市售腐竹中碱性嫩黄O 的测定 按“2.4”项下方法处理及测量样品，几批次样品均未检出碱性嫩黄O。在3 个腐竹样品中分别添加3 个不同水平(0.5、0.8、1.2μg·mL－1)的标准溶液，平均回收率介于91.4% ～96.2%。腐竹加标样品溶液经SPE 柱处理后，洗脱液呈现的HPLC 图谱(见图3)碱性嫩黄O 峰分离度较高，证明该SPE 柱具有较好的实用性。

图3 碱性嫩黄O 标准品(A)

及腐竹固相萃取洗脱液(B)的高效液相色谱图

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