新疆伊贝母种质资源的ISSR 遗传多样性分析

詹羽姣， 盛 萍 ， 姚 蓝， 史 红， 张 煊

(新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐830011)

伊贝母为百合科植物新疆贝母Fritillaria walujewii Regel 或伊犁贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鳞茎，具有清热润肺，化痰止咳之功效，收载于《中国药典》历届版本中［1］。其与川贝母功效相同，临床上常用于治疗肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳咳、咳痰带血等症。伊贝母野生品种仅分布于我国新疆，为国家三级重点保护野生药材［2-3］，由于该植物资源破坏严重，因此为满足市场需求，60 年代起新疆开展伊贝母资源野生品变家种实验，70 年代成功引种并大量投入医药市场。目前，新疆药材市场上流通的伊贝母多为境内巩留县、新源县、霍城县、温泉县等地的人工栽培品，但新疆地形多变，独特的自然条件对该植物的种间变异和种质资源有很大影响［4］。所以，对伊贝母野生品与栽培品的种质资源进行考察，将给科学合理地开发、利用及保护该植物，并保证其临床用药疗效带来重大意义。

简单重复区间序列(ISSR)是一种新型分子标记技术，现已广泛应用于植物品种鉴定及遗传多样性分析等研究中［5-6］。目前，应用该技术对贝母属药用植物川贝母、浙贝母、平贝母的种质资源遗传多样性研究较多［7-12］，但对伊贝母这一方面的研究尚未见报道。因此，本实验采用ISSR 分子标记技术，对新疆不同产地伊贝母的16 个野生和栽培居群，共128 份样品进行遗传多样性分析，计划从DNA 分子水平探讨该植物的群体遗传结构和多样性水平，了解其野生和栽培品种遗传纯度，保证其临床疗效，为伊贝母种质资源的综合评价、合理利用及品种保护提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 材料 药材于2012 年5 月—6 月采集于新疆省不同产地，每个产地随机选取样品植株，采集其幼嫩叶，置于硅胶袋中迅速干燥，保存于-20 ℃冰箱中备用，样品信息见表1。经鉴定，它们均为百合科植物新疆贝母F. walujewii Regel 或伊犁贝母F. pallidiflora Schrenk 的干燥鳞茎，标本保存于新疆医科大学中医学院中药资源教研室。

Plant Genomic DNA Kit 植物基因组DNA 提取试剂盒(离心柱型)、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+、10 × Buffer、2000kb DNA Marker、Gelview(天根生化科技北京有限公司);引物(上海生工有限公司，根据加拿大哥伦比亚大学公布的第9 套ISSR 引物序列合成)。

1.2 仪器 Anke TGL-16C 离心机(上海安亭科学仪器厂);DYY-7C 电泳仪 (北京六一仪器厂);Bio-Rad C1000 PCR 扩增仪(美国Bio-Rad 公司);琼脂糖凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)。

表1 不同居群伊贝母种质信息Tab.1 Information of different populations of Yibeimu

2 方法

2.1 基因组总DNA 提取 课题组前期已对伊贝母的总DNA 提取方法 (改良的CTAB 法、改良的SDS 法与试剂盒法)进行比较研究，发现试剂盒法为最佳方法。因此，本实验采用Plant Genomic DNA Kit 试剂盒(离心柱型)提取植物基因组的DNA，操作步骤参照说明书。然后，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整性，核酸蛋白测定仪检测其浓度及纯度，并将总DNA 质量浓度稀释至50 ng/μL，保存于4 ℃冰箱备用。

2.2 扩增与成像 采用优化的伊贝母ISSR-PCR体系，对74 条引物进行筛选，得到15 条条带清晰、多态性丰富且重复性较好者用于PCR 扩增。其ISSR-PCR 最适体系(50 μL)为Mg2+2.50 mmol/L、dNTPs 0.30 mmol/L、Primer 0.80 μmol/L、Taq DNA 聚合酶0.75 U、模板DNA 1.00 ng/μL、10 ×Buffer 5 μL、ddH2O 33.4 μL。PCR 扩增程序为95 ℃预变性7 min，变性30 s，退火(根据引物不同设定温度)45 s，72 ℃延伸90 s，循环45 次，72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。然后，Gelview 染色扩增产物，DL2000 DNA Marker 作相对分子质量标准检测，2%琼脂糖凝胶于115 V 电压下电泳50 min，在紫外凝胶成像系统下观察，并拍照分析。

2.3 数据统计分析 每份材料的电泳结果采用0/1 赋值记带，ISSR 分子标记为显性标记，有条带(包括强带和弱带)者记为“1”，无条带者记为“0”，数据统计后记录于Excel 表格中。接着，Popgene32 软件对所统计的数据进行分析，得到遗传结构和遗传多样性的参数。最后，NTSYS-PC 软件进行聚类分析，采用SHAN 程序构建聚类图。

3 结果与分析

3.1 ISSR 扩增结果 74 条引物中筛选出15 条条带清晰、多态性较好者，对128 份伊贝母进行ISSR-PCR扩增，用于分析其不同居群的多态性，结果电泳产生了清晰条带，部分引物的扩增图谱见图1。而且，15条引物共检测出239 条条带，其中多态性位点227 个，相对分子质量大多在200 ～1 600 bp 之间，多态性位点百分率为94.98%，见表2。

图1 部分引物对部分伊贝母样品的扩增结果Fig.1 Amplification results of a part of primers for some samples of Yibeimu

表2 伊贝母ISSR 扩增结果和多态性分析Tab.2 ISSR amplification result and polymorphism analysis of Yibeimu

3.2 伊贝母植物居群间的遗传多样性 采用Popgene32 软件，对伊贝母16 个居群的128 份样品进行分析，见表3。结果显示，该植物不同居群间各自的多态性位点百分率 (PPB)在22.59%～53.56%之间，其中吉木萨尔县大有乡野生居群的PPB 最高(53.56%)，而新源县那拉提栽培居群的最低(22.59%)。16 个伊贝母居群的等位基因数(Na)为1.949 8 ±0.218 8，有效等位基因数(Ne)为1.342 6 ± 0.309 9，Nei’s 多样性指数(H)为0.219 0 ±0.160 3，Shannon’s 信息指数(I)为0.350 3 ±0.217 0，表明其资源在DNA 分子整体水平上有较高的遗传多样性。

表3 伊贝母16 个居群的遗传多样性Tab.3 Genetic diversities of 16 populations of Yibeimu

3.3 伊贝母不同居群的遗传分化 由伊贝母16 个居群之间的遗传分化水平可知，其总基因多样度(Ht)为0.222 7 ±0.026 6，遗传多样度(Hs)为0.104 6 ±0.005 5，居群间的遗传分化指数(Gst)为0.530 4，即在总遗传变异中有53.04%存在于居群间，46.96%存在于居群内，显示出遗传多样性变异大多存在于居群间。另外，基因流(Nm*)为0.442 7，表明居群间的基因交流程度比较有限。

3.4 伊贝母植物的聚类分析和亲缘关系 采用NTSYS-PC 软件和UPGMA 法，并根据Nei’s 遗传距离，对128 份伊贝母进行聚类分析，见图2。由图可知，种质间的遗传相似系数在0.69 ～0.95之间，并且在GS =0.69 处，可将伊贝母明显分为两大类，P1 ～P10 为第一大类 (新疆贝母);P11 ～P16 为第二大类 (伊犁贝母)。另外，在GS=0.71 处，又可将新疆贝母分为两组，米泉林场哈熊沟、吉木萨尔大有乡、木垒县照壁山的7 份野生种质样品为第一组;木垒县照壁山的3份野生种质样品与奇台县吉布库水电站、呼图壁雀儿沟、玛纳斯清水河、沙湾林场、乌苏白杨沟、乌苏巴音沟的所有野生种质样品和新源县那拉提的所有8 份栽培种质样品为第二组。由此可知，新疆贝母野生与栽培种质资源遗传多样性水平的相似性较高。另外，在GS=0.774 处，可将伊犁贝母分为两组，霍城县果子沟、伊犁赛里木湖、温泉边防哨所、霍城县芦草沟的所有野生种质样品及7 份栽培种质样品为第一组;霍城县芦草沟的3 份栽培种质与巩留县莫乎尔乡、新源县那拉提的所有栽培种质样品为第二组，这也表明伊犁贝母野生与栽培种质资源遗传多样性水平的相似性较高。

由遗传相似性可看出，所采集的伊贝母具有较高的遗传多样性，被分成的两大类(新疆贝母和伊犁贝母)也正与其品种来源相符。图2 显示，新疆贝母中的77 ～84 号样品聚为一类，为栽培品种;70 ～76 号样品聚为一类，为野生品种;70 ～84 号样品，即野生与栽培品种，又可共聚为一类。伊犁贝母中的97 ～100 号样品聚为一类，为野生品种;101 ～107 号样品聚为一类，为栽培品种;97 ～107 号样品，即野生与栽培品种，又可共聚为一类。综上所述，新疆贝母和伊犁贝母的野生与栽培品种均可分别聚为一类，而且无明显差异。

图2 128 份伊贝母样品基于ISSR 分析的UPGMA 聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram of 128 Yibeimu samples based on ISSR analysis

为了进一步分析伊贝母居群间的遗传分化程度，本实验计算了其Nei’s 遗传一致度(I)和遗传距离(D)，见表4。结果显示，16 个伊贝母居群间I 的变化范围在0.734 4 ～0.966 6 之间，而D在0.034 0 ～0.308 8 之间，表明吉木萨尔大有乡(新疆贝母野生品)与木垒县照壁山(新疆贝母野生品)的遗传一致度最高(0.966 6)，遗传距离最小(0.034 0)，即两者的遗传差异较小，亲缘关系最近;沙湾林场(新疆贝母野生品)与温泉边防哨所(伊犁贝母野生品)的遗传一致度最低(0.734 4)，遗传距离最大(0.308 8)，即两者的遗传差异较大，亲缘关系最远，提示地理位置的远近对遗传一致度和遗传差异也有较大影响。

4 讨论

4.1 伊贝母的遗传多样性水平及遗传分化 本实验对16 个居群128 份伊贝母的ISSR 遗传多样性进行分析，发现其代表性较好，种质资源具有较高的遗传多样性，而且栽培品种的遗传纯度与野生品种接近，这可能与目前该植物的合理引种栽培与野生种质资源保护密切相关。另外，由伊贝母16 个居群之间的遗传分化水平显示，其总遗传变异中有53.04%存在于居群间，而余下的46.96%存在于居群内，基因流(Nm*)为0.442 7，表明居群间的基因交流程度比较有限，存在遗传分化。

表4 伊贝母16 个居群遗传一致度(I，对角线以上)和遗传距离(D，对角线以下)Tab.4 Genetic similarity coefficients (I，above diagonal)and genetic distance (D，below diagonal)in 16 populations of Yibeimu

4.2 伊贝母的聚类分析及遗传距离 根据Nei’s遗传距离得到的聚类图可知，各种质间的遗传相似系数介于0.69 ～0.95 之间，128 份样品被明显分为两大类，恰好与其品种来源(新疆贝母和伊犁贝母)相符，并未根据野生和栽培样品聚类，也未完全按照地区聚类，说明伊贝母的野生与栽培品种之间无明显差异。而且，I 和D 的分析结果显示，野生新疆贝母之间的遗传差异较小，而野生新疆贝母与伊犁贝母之间的亲缘关系最远，提示地理位置的远近对遗传一致度和遗传差异有较大影响。

4.3 伊贝母种质资源评价 本实验采用ISSR 分子标记技术，从分子水平上研究伊贝母的种群结构和遗传多样性水平。结果表明，该植物在总体上具有较丰富的遗传多样性，能适应环境的变化。目前，大部分伊贝母栽培品种的遗传纯度已很高，可保证其药材质量和临床疗效，并为该植物种质资源的综合评价、合理利用及品种保护提供了科学依据。

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