速效止泻胶囊质量标准的研究

刘 宇， 张明明， 刘墨祥

(扬州大学医学院 天然药物研究室，江苏 扬州225000)

速效止泻胶囊是依据《卫生部药品标准中药成方制剂》第13 册制订的处方和制法而生产的中成药，该制剂由盐酸小檗碱和拳参组成，其主要功能为清热利湿，收敛止泻，用于赤痢、热泻、肠炎等［1］。拳参具有清热解毒、消肿、止血之功效，主治赤痢热泻、肺热咳嗽、痈肿瘰疬、口舌生疮、血热吐衄、痔疮出血、蛇虫咬伤［2］。现代抗菌实验表明拳参对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌等均有抗菌作用［3-4］，其有效成分主要为没食子酸和绿原酸。有文献报道了测定速效止泻胶囊中盐酸小檗碱［5-7］和没食子酸及绿原酸的含有量［8-10］，但拳参原药材对胶囊质量的检测影响均没有提及。鉴于速效止泻胶囊中盐酸小檗碱［11-12］是以化合物定量加入质量可控，而其中的没食子酸、绿原酸、儿茶酚及可水解生成没食子酸的鞣质等有效成分的含有量则随拳参原料药材的质量而异，需有效技术监控。所以，本研究拟针对速效止泻胶囊中拳参的主要有效成分没食子酸和绿原酸两个指标建立简便、灵敏、准确的RP-HPLC 定量检测方法与技术，并针对速效止泻胶囊中拳参所共有的多个指标成分建立专属性强、方法简便的高效液相色谱指纹图谱定性鉴别方法与技术;同时对野生拳参特征峰进行识别。

1 仪器与试药

Waters 高效液相色谱仪，包括Waters 1525 Binary HPLC Pump 色谱泵，Waters 2487 双通道紫外检测器，色谱柱恒温箱;Waters SymmetrySheildTMRP18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，包括Empower 色谱工作站;Sartorius CAP225 电子天平(德国赛多利斯公司)。没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，纯度为0.899，批号110831-201204);绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，纯度为0.966，批号110753-201314)。速效止泻胶囊 (甘肃岷海制药有限责任公司，批号130701)。野生拳参饮片(苏北人民医院)，经扬州大学刘墨祥教授鉴定。乙腈和甲醇为色谱纯;甲酸为分析纯;水为超纯水。

2 溶液制备

2.1 对照品溶液制备 分别精密称定适量没食子酸和绿原酸对照品，加50%甲醇制成对照品混合溶液，其中没食子酸质量浓度为183.39 μg/mL，绿原酸质量浓度为208.65 μg/mL。

2.2 供试品溶液制备 从同一批次胶囊中取出10粒，将胶囊粉末混合并研细，取0.1 g，精密称定后，置于10 mL 具塞试管中，精密加入6 mL 50%甲醇，密封并称定质量，浸泡2 h，30 ℃下超声20 min，冷却至室温后再称定质量，加50%甲醇补足减失质量，摇匀，过0.45 μm 滤膜，取续滤液，即得。

2.3 阴性样品溶液制备 按处方制备不含拳参的阴性样品，取适量，按“2.2”项方法制成阴性样品溶液。

3 色谱条件

采用Waters SymmetrySheildTMRP18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mmm);流动相为0.1%甲酸溶液(A)-乙腈 (B)，梯度洗脱 (0 ～10 min，92.5%A;10 ～11 min，92.5% ～90% A;11 ～40 min，90%A);体积流量0.8 mL/min;柱温30 ℃;检测波长290 nm;通过20 μL 定量环保持进样量恒定。

4 方法与结果

4.1 专属性试验 分别吸取供试品溶液、对照品混合溶液和阴性样品溶液注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定，进样量均为20 μL，记录色谱图。没食子酸和绿原酸的保留时间分别为8.824 min 及34.573 min，待测组分峰形良好且与相邻组分达到基线分离，不受其他组分干扰，分离度均大于2，理论塔板数以没食子酸和绿原酸计算均大于8 000 (见图1)。

4.2 线性关系考察 精密量取“2.1”项下的对照品混合溶液2 mL，精密吸取1 mL 置于指形管中作为待测样品1，剩余的1 mL 对照品混合溶液中精密加入50%甲醇1 mL，得到2 mL 稀释了1 倍的对照品混合溶液。按上述方法重复操作4 遍，得到倍比稀释的6 个质量浓度样品溶液，在上述色谱条件下，分别注入液相色谱仪，进样量均为20 μL。以对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标(C)，测定的峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得没食子酸和绿原酸线性回归方程为Y=5.618 7 ×104C-0.164 53 × 104(r = 1);Y = 5.577 9 × 104C -12.202 8 ×104(r =0.999 9)。结果表明没食子酸在5.73 ～183.39 μg/mL、绿原酸在6.52 ～208.65 μg/mL 范围内线性关系良好。

图1 混合对照品、样品和阴性样品色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances，samples and negative sample

4.3 精密度试验 吸取对照品混合溶液，按照上述色谱条件测定，进样量为20 μL，连续进样5次，记录峰面积。结果没食子酸峰面积的RSD 为1.4%，绿原酸峰面积的RSD 为0.6%，表明所用仪器的精密度良好。

4.4 重复性试验 取同一批(批号130701)胶囊粉末5 份，每份0.1 g，精密称定，按“2.2”项下方法制成供试品溶液，依法测定。没食子酸平均含有量为1.45 mg/g (RSD =1.2%)，绿原酸平均含有量为5.34 mg/g (RSD =1.1%)，表明方法重复性良好。

4.5 稳定性试验 吸取同一供试品溶液(批号130701)，按上述色谱条件间隔不同时间测定5 次，没食子酸和绿原酸RSD 分别为1.1%和0.7%，表明供试品溶液在室温条件下放置12 h 后没食子酸和绿原酸的质量浓度无明显改变，方法稳定可行。

4.6 加样回收试验 参照“4.4”项下所测样品中没食子酸和绿原酸的含有量，精密称取没食子酸和绿原酸对照品适量，分别加入50%甲醇制得供加样回收用对照品溶液，其中没食子酸和绿原酸质量浓度分别为141.07 μg/mL 和521.64 μg/mL。称取“2.2”项下研细的胶囊粉末样品 (批号130701)约0.1 g，共5 份，精密称定，在样品中分别精密加入上述对照品溶液没食子酸1 mL、绿原酸1 mL、50%甲醇4 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3”项色谱条件进行测定，计算回收率(见表1)。

表1 加样回收试验结果(n=5)Tab.1 Result of recovery tests (n=5)

5 样品测定

按上述色谱条件，对不同批次的速效止泻胶囊样品进行测定，记录峰面积，代入标准曲线方程计算没食子酸和绿原酸量(见表2)。

表2 样品测定结果(n=5)Tab.2 Result of determination of samples (n=5)

6 讨论

6.1 没食子酸峰和绿原酸峰的确认 文献［13-14］报道拳参中含有没食子酸和绿原酸，而在本实验色谱条件下，速效止泻胶囊提取样品的两个色谱峰与没食子酸和绿原酸对照品的色谱峰保留时间一致，且紫外光谱图吻合，于是将样品进行HPLCMS 鉴定，在正负离子检测条件下，8.5 min 时分别出现m/z 171、169 分子离子峰，34.5 min 时分别出现m/z 355、353 (见图2)分子离子峰，本实验对速效止泻胶囊提取样品中保留时间为8.5 min和34.5 min 的色谱峰从保留时间、紫外光谱图、相对分子质量三方面验证其分别为没食子酸和绿原酸。

图2 没食子酸与绿原酸质谱图Fig.2 Spectra of gallic acid and chlorogenic acid

6.2 提取方法、溶剂、时间的考察 样品中没食子酸和绿原酸来自拳参粉末，参考文献［13-14］，提取方法和时间考察了冷浸法，分别考察了冷浸2 h后30 ℃超声20、40 min 及冷浸放置过夜后30 ℃超声20、40 min。结果表明冷浸2 h 后超声提取待测组分没食子酸和绿原酸提取效果比较好，而且节省时间，所以提取方法确定为冷浸2 h 后30 ℃超声20 min。所测组分为酚酸类，易溶于水和强极性溶剂中，考察了水、20% 乙醇、50% 乙醇、30%甲醇、50%甲醇的提取情况。结果显示50%甲醇提取效果比较好，确定提取溶剂为50%甲醇。

6.3 流动相的选择 对甲醇-超纯水(25 ∶75)、甲醇-0.4%冰醋酸(25 ∶75)、甲醇-0.1 磷酸(10∶90)、乙腈-0.4%冰醋酸(10 ∶90)、乙腈-0.1%磷酸(10 ∶90)、乙腈-0.1%甲酸(梯度)不同流动相进行考察，发现乙腈作为有机相时系统柱压比较小，流动相中加入一定量甲酸和磷酸均可改善峰形和分离度，为了增加色谱柱的稳定性和使用寿命，以及后期液质联机对指纹峰识别时不适合用磷酸，所以选用乙腈-0.1 甲酸(梯度)。

6.5 检测波长的选择 没食子酸在220 nm 及270 nm 处有最大吸收，绿原酸在218 nm 及327 nm 处有最大吸收，为使二者均有较好且相当的灵敏度，选择290 nm 为检测波长［15］。

［1］ 《卫生部药品标准中药成方制剂》第13 册:速效止泻胶囊［S］.

［2］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2010 年版二部［S］. 北京:中国医药科技出版社，2010:271.

［3］ 张齐雄，曹 蓓. 中药拳参生物活性研究进展［J］. 亚太传统医药，2012，8(7):195-196.

［4］ 梁 波，张小丽. 中药拳参化学成分及药理活性研究进展［J］. 甘肃高师学报，2008，13(5):53-55.

［5］ 彭晓君，何书莲，傅海鸥. 速效止泻胶囊的质量标准研究［J］. 中国伤残医学，2008，16(4):31-32.

［6］ 刘冬凌，胡 波，熊文碧. HPLC 测定速效止泻胶囊中没食子酸的含量［J］. 华西药学杂志，2007，22(2):214-215.

［7］ 赖先荣，刘惠莲. 速效止泻胶囊含量测定方法的初步研究［J］. 现代生物医学进展，2006，6(10):57-59.

［8］ 熊灿琼，王义飞，吴 娟. HPLC 法测定速效止泻胶囊中盐酸小檗碱和没食子酸的含量［J］. 中国药事，2008，22(10):899-912.

［9］ 张 玮，陈小清. HPLC 法测定拳参药材中没食子酸的含量［J］. 宜春学院学报，2008，12(6):119-120.

［10］ 张莲秀. HPLC 法同时测定速效止泻胶囊中没食子酸和绿原酸含量［J］. 海峡药学，2012，24(10):98-100.

［11］ 阳 勇，李铁刚，朱晶晶，等. HPLC 法测定黄连药材及其炮制品中主要生物碱的含量［J］. 中成药，2010，32(9):1540-1544.

［12］ 马启武，杨 畅，刘秋雨，等. 速效止泻胶囊体外溶出度测定方法研究［J］. 中国实验方剂学杂志，2013，19(20):108-111.

［13］ 黄加宝，林 娜，李安珍. 高效液相色谱法测定拳参中没食子酸的含量［J］. 时珍国医国药，2007，18(8):1909-1910.

［14］ 张 萍，朱尘琪，晁 冲，等. HPLC 法测定2 种不同颜色拳参饮片中绿原酸及没食子酸含量［J］. 药物分析杂志，2014，34(7):1305-1309.

［15］ 刘 瑞，何方奕，李 磊，等. 高效液相色谱法同时测定拳参药材中没食子酸和绿原酸的含量［J］. 药物分析杂志，2005，25(4):390-393.