岷江柏野生居群和迁地保护居群的遗传多样性比较

常二梅 刘建锋 黄跃宁 李红丽 单冰燕 江泽平 赵秀莲*

（1. 中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091；2. 国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091；3. 北京林业大学，北京 100083；4. 邯郸市永年区农业农村局，河北 056011；5. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京 100091）

岷江柏（）为国家二级保护植物，主要分布在岷江流域、大渡河流域和白龙江流域，是特有的水土保持和先锋造林树种之一，具有很高的生态和研究价值。前期的研究表明野生岷江柏具有较高的遗传多样性，受人为干扰等因素造成野生居群的遗传多样性水平逐渐降低。四川大渡河中上游地区的岷江柏数量约占野生岷江柏数量的90%。近年，由于四川大渡河水电站的开发，造成两岸的野生岷江柏直接被淹没，岷江柏野生种群面积日益缩小，而野生天然林的遗传多样性、稳定性高于人工林。因此，保护野生岷江柏种质资源势在必行。

大量研究表明迁地保护是有效保护野生物种居群延续的有效方法。迁地保护后的居群遗传多样性、遗传结构及居群间基因流等是迁地保护有效性的指标。对濒危的野生物种如黄梅秤锤树（）、金花茶（）的迁地保护居群和其野生居群进行遗传多样性和遗传结构状况对比分析，发现迁地保护能有效地保存这些植物的种质资源，但是仍存在迁地保护居群较小的问题。而狭叶坡 垒（）、广 西 火 桐（）、南方红豆杉（var.）迁地保护居群的遗传多样性较低，这可能是迁地保护中收集种子的范围小，没有涵盖整个居群。因此，对野生居群和迁地保护居群的遗传多样性评价对于濒危植物居群保育具有重要意义。

将物种从野生状态下移栽到某一地方后其遗传多样性可能会发生变化，GBS 测序技术能有效地对种质资源居群结构和遗传多样性进行研究，如利用InDel 和SNP 位点分析宽皮柑橘（）、密花石斛（）的居群遗传和进化。岷江柏迁地保护的地理位置与原来野生居群的地理位置不同，海拔、气温及湿度等生长环境差异较大。而对于迁地保护后的岷江柏居群和野生居群遗传多样性、居群结构等诸多方面评价还缺乏较为系统的研究。因此，本文利用GBS（Genotyping-by-Sequencing）高通量测序技术和生物信息分析技术，通过对野生居群和迁地保护居群分别进行遗传多样性分析对比，探索这两类居群在居群遗传结构和系统发育等方面的关系和差异。经过对岷江柏野生居群分布情况进行全面清查，为岷江柏野生居群的迁地保护提供技术保障和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2012年开始的四川大渡河上游长河坝电站建设直接影响野生岷江柏的生存环境及物种保护，2019年8月对4个地点的岷江柏居群进行采样（具体分布地点见表1）。选取当卡土料场移栽的不同高度（＜1.0 m、1.0～1.5 m、1.5～2.0 m、2.0～2.5 m、2.5～3.0 m）的移栽苗18 株、当卡土料场人工播种苗4株、松岗镇野生苗4株，热足电站野生苗3株，白湾隧道野生苗4 株。采集以上33 株的当年生叶片放入液氮中保存备用。

表1 供试的岷江柏居群概况Table 1 The status of populations of C.chengiana

1.2 试验方法

利用CTAB 法提取岷江柏叶片的DNA，用OD值和质量浓度为1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的质量和浓度。质量合格的DNA 进行PCR 扩增。建立文库并经过纯化、库检，Hiseq X10 PE150 上机测序。通过测序质量评估过滤后得到测序原始数据。使用聚类软件stacks（1.43）对合格的测序数据进行reads 聚类，设置参数为-m6-M 6-N0-i1-H，得到tags。再对tags进行overlap处理，对于没有overlap的tags用N进行链接，最后用脚本制作成大小一致的假基因组进行后续分析。

1.3 生物信息学分析

对于鉴定到的SNP 和InDel 用Annovar 软件进行注释。根据得到的SNP 信息，计算样品间距离，对样品进行居群主成分分析（PCA 分析）、聚类分析、构建分子进化树，从而推断出居群间的亲缘关系远近。

利用POPGENE version 1.32 软件分别计算观察样本的杂合度（）、期望杂合度（）、基因多样性指数（）、多态信息含量（）、Shannon 信息指数（）、固定指数F（Fixed index）、核苷酸多样性（）、遗传分化指数（）及基因流（）。使用treebest 软件，通过邻接法（neighbor-joining methods）构建进化树。使用Admixture软件进行居群结构分析。居群结构分析图注：以每种颜色代表一个居群，用每个竖线块代表一个样本；每个竖线块的宽度代表在祖先居群中的比例。居群结构交叉验证分析图注，找到最合适的值。

2 结果与分析

2.1 测序质量

将18 株岷江柏移栽个体、4 株播种个体及11株野生岷江柏个体进行GBS 测序，共获得Clean Data 118 321 514 728 bp，Q平均值为96.81%，Q平均值（测序碱基质量值，即测序时错误识别的概率是0.1%、正确率为99.9%的碱基比例）为91.23%，GC 含量为35.22%，岷江柏居群过滤后的SNP 位点有1 259 610个。

2.2 岷江柏迁地保护和野生居群的遗传聚类

根据岷江柏居群测序过滤后的1 259 610 个SNP 位点进行分析，构建迁地保护居群和野生居群个体的系统发育进化树（见图1），从图1 的可以看出，共分5 个分支，第1 分支包括高度为2.0～2.5 m、2.5～3.0 m 的当卡土料场移栽地的岷江柏个体；第2 分支包括高度为2.5～3.0 m 的当卡土料场移栽地岷江柏个体、苗圃地的播种种植的岷江柏个体、热足电站野生岷江柏个体；第3 分支包括高度为1.0～1.5 m、1.5～2.0 m 的卡土料场移栽的岷江柏个体，第4 分支包括高度小于1.0 m 当卡土料场移栽的岷江柏个体、苗圃地播种种植的岷江柏个体、白湾隧道野生的岷江柏个体聚在一起；尤其是第5分支包括当卡土料场移栽种植的岷江柏个体、热足电站野生的岷江柏个体、白湾隧道野生的岷江柏个体、松岗镇野生的岷江柏个体，表明移栽的岷江柏个体和野生的岷江柏个体之间有较近的亲缘关系。

图1 泯江柏个体系统发育进化树Fig.1 Individual phylogenetic tree of C.chengiana

2.3 岷江柏迁地保护和野生居群的主成分分析

居群主成分分析能反应出岷江柏个体之间的亲缘关系（见图2）。PC1、PC2 的贡献率分别为3.77%和3.65%，累计贡献7.42%。PC2、PC3 的贡献率分别为3.65% 和3.46%，累计贡献7.11%。PC1、PC2、PC3 共同解释了10.88%的总变异。贡献率低说明33个岷江柏个体没有被分开。不同地点间的个体在PCA 图上的分布分散，但没有明显的分群现象，这也表明所有个体之间亲缘关系较近。与岷江柏个体系统发育进化树的结果相似，表明移栽的岷江柏个体没有产生遗传变异，表明这些岷江柏个体可能是来自同一个居群。

图2 岷江柏迁地保护和野生居群的主成分分析Fig.2 The analysis of principal componentsof wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

2.4 岷江柏迁地保护和野生的居群结构

通过Structure 软件基于开发出的1 259 610个SNP 位点，将迁地保护居群和野生居群的33 个岷江柏个体进行交叉验证聚类。从图3 可以看出交叉验证错误率的谷值确定最优分群数为1。值设置为1～9 进行聚类（见图4），聚类情况及各个值对应的交叉验证错误率，值等于2～5、8～9 时，DK-a4 和RJ-d1 聚在一起，说明这两个个体亲缘关系较近，移栽居群和野生居群的遗传多样性差异不大。结果表明33 个岷江柏个体为一个居群，进一步说明聚类的准确性，可以判断岷江柏移栽后遗传多样性没有发生改变。

图3 岷江柏迁地保护和野生居群的不同K 值所对应的的交叉验证错误率Fig.3 The admixture validation error rate corresponding to the different K values of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

图4 岷江柏迁地保护和野生居群的Structure聚类分析Fig.4 Structure clustering of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

2.5 岷江柏遗传多样性

当卡村的迁地保护居群、松岗镇野生居群、热足电站野生居群和白湾隧道野生居群4 个居群的遗传多样性分析结果显示观测杂合度（）、期望杂合度（）、基因多样性指数（）及Shannon 信息指数（）的平均值分别为0.243 7、0.303 1、0.308 6、0.470 7（见表2）。当卡土料场的迁地保护居群的、、的值分别为0.300 3、0.308 9、0.464 9，均高于其他居群，说明迁地保护的岷江柏居群遗传多样性最高。多数位点的观测杂合度均小于期望杂合度，这可能与居群内存在不同程度的近交、所取样本小等有关。值在-0.031 9～0.187 0，值在0.272 2～0.308 9，4个岷江柏居群的F_index值进行比较，当卡土料场的迁地保护居群为0.246 5，位列第一，松岗镇野生居群最低，为0.178 0。这个分析结果说明本研究中不同地理来源的岷江柏居群基因的多样性水平较高，当卡土料场的迁地保护居群的遗传多样性水平最高，热足电站野生居群、白湾隧道野生居群遗传多样性水平次之，而松岗镇野生居群最低。

表2 岷江柏迁地保护和野生居群间的遗传多样性分析Table 2 Analysis of genetic diversity of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

值是表征居群间的遗传分化程度（见表3），对比后发现BW_vs_DK、BW_vs_RJ、DK_vs_RJ 的值在0～0.05，说明岷江柏居群间的遗传分化很弱；DK_vs_SA 和BW_vs_SA 在 的值 在0.05～0.15，说明岷江柏居群间遗传分化属于中等水平；在5 个成对居群的值中，没有成对居群的值大于0.25。由此可知，4 个岷江柏居群间几乎不存在着明显的遗传分化。DK_vs_SA 和BW_vs_SA 的值分别为3.541 3 和2.497 0，表现出较高的基因交流水平。BW_vs_DK、BW_vs_RJ、DK_vs_RJ 的值分别为6.805 6、5.173 3 和10.815 9，表现为高度的基因交流水平，说明当卡土料场的迁地保护居群和热足电站野生居群的遗传距离最近，并且可以看出岷江柏居群间的遗传分化程度较小。

表3 岷江柏迁地保护和野生居群间的遗传分化系数和基因流参数Table 3 Genetic diversity and genetic differentiation parameters of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

对不同岷江柏居群间遗传距离的研究有助于对其遗传多样性的研究，也可以用来表述岷江柏居群间遗传结构差异。对于不同居群之间的居群遗传多样性可通过Pairwise统计来进行研究。DK_vs_SA和BW_vs_SA的值分别为0.151和0.152，说明遗传有显著差异，表明其遗传距离与其他居群也较远。从表4可看出，迁地保护的居群与热足电站和白湾隧道野生岷江柏居群Fst值均没有表现出显著性差异，这3个居群的遗传距离较近。

表4 各居群之间差异位点Pairwise Fst统计Table 4 Pairwise Fst summary statistics for all variant positions between each population

3 讨论

以往研究中，GBS 技术利用开发的SNP 标记应用于小麦（）、砂生槐（）、沉 水 樟（）、牛樟（）等许多植物的居群遗传分析。本研究运用GBS 技术鉴定的SNP 位点分析发现大部分群聚在一起的迁地保护岷江柏居群和野生岷江柏居群，没有明显的分群现象。这与广西火桐植物园迁地保护居群和部分野生居群聚在一起的结果相似，说明迁地保护岷江柏居群和野生居群的遗传多样性差异不大。

保存野生岷江柏居群的遗传多样性是迁地保护成功的关键。本文中迁地保护的岷江柏居群的=0.300 3，=0.464 9，这高于四川省和甘肃省的8 个自然居群使用ISSR 方法测定的=0.226，=0.347 和AFLP 方 法 测 定 的=0.113，=0.171，这些岷江柏居群的＜，可能是岷江柏居群的近交严重造成的。但是在以往的研究中大部分迁地保护的居群的遗传多样性水平均低于野生居群，如：金花茶居群、狭叶坡垒，这可能是迁地保存的种子繁殖苗采取了同一棵母株的种子，从而降低了单位引物多态位点比率。岷江柏居群迁地保护居群遗传多样总体水平略高于野生居群，主要可能有两个原因：一是移栽能较好的保存野生居群遗传多样性；二是在迁地保存的移栽苗来自多个自然居群，从而增加了遗传多样性水平。

岷江柏的4 个居群中只有BW_vs_SA 的遗传分化程度中等。另外其他居群的＜0.05，＞4，表明这些居群间没有遗传分化，居群间的基因交流频繁。四川省（=0.475，=0.553）和甘肃省（=0.4791，=0.5436）采集的8 个自然居群出现了明显的遗传分化，居群间的基因流动频率较低。在迁地保护狭叶坡垒、广西火桐、南方红豆杉居群时，也存在一定程度的遗传分化，基因流较低，这可能是自然居群中的野外幼苗成活率低，从而限制了居群间的基因交流，增加了居群间的遗传分化。本研究的岷江柏迁地保护居群和野生居群可能范围较近，因此遗传上居群间没有出现显著差异。因此，在迁地保护过程中尽可能扩大迁地保护居群的规模，增大迁地保护的个体数量，以增加其遗传多样性水平，同时开展长期监测和适应性评价，提高迁地保护效率。

4 结论

利用鉴定到的1 259 610个SNP位点分析发现大部分迁地保护的移栽岷江柏居群和野生岷江柏居群聚在一起，没有明显的分群现象。迁地保护的移栽岷江柏居群遗传多样性较高，并且居群间没有遗传分化，居群间的基因交流频繁。因此，为更好地保护岷江柏居群遗传水平，迁地保护过程中应尽可能多地从尚未进行过收集的各自然居群中采集繁殖材料，为其他野生植物的迁地保护评价提供参考。