UPLC/Q-TOF-MS 法检测2 种中成药中土霉素、马来酸氯苯那敏和醋酸泼尼松

彭耀文， 申兰慧， 王 丽， 金 坚， 杨敏智*

(1. 江南大学药学院，江苏 无锡214122;2. 江苏省无锡药品检验所，江苏 无锡214028)

哮喘病在我国一些地区发病率较高，而中药治疗哮喘历史悠久，疗效肯定，并且具有药源丰富、毒副作用小、价格低廉等优点，因此一直深受患者的喜爱。但近来发现市场上某些所谓“强效、速效”治疗哮喘的“纯中药制剂”，往往被非法掺入治疗哮喘化学药物成分［1］。马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松均为目前临床上治疗哮喘病的常用药物，但都具有一定的毒副作用;土霉素 (Oxytetracycline)，又名氧四环素，是四环素类广谱抗生素，目前常用于预防和治疗动物疾病［2］。近年来对中药制剂中非法添加马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的检测方法进行了大量报道［3-10］;而土霉素在兽药中非法添加有文献［11-13］报道，但在中药制剂中非法添加土霉素的检测方法尚未报道。本实验建立UPLC/Q-TOF-MS 法，能快速准确地同时判断中药制剂中是否非法添加土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松，为药品监督管理部门对止咳平喘类中成药及保健品的打假工作提供可靠的技术支持，保证人民用药安全。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1290 UPLC-6530AQ-TOFMS 仪，配有柱温箱、DAD 检测器、大气压离子源ESI、MassHunter 工作站等(超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用仪，美国Agilent 公司);电子天平(XS205，梅特勒公司);超声仪(KH-300E，昆山禾创超声仪器有限公司);MilIipore 纯水系统(美国Millipore 公司)。

1.2 试药 对照品土霉素 (批号 130487-200703)、马来酸氯苯那敏 (批号 100047-200606)、醋酸泼尼松(批号100012-200706)均购自中国食品药品检定研究院。样品咳喘王胶囊(标示为北京某研究中心，批号20140106，0.5 g/粒)、清肺胶囊(标示为河北某制药有限公司，批号20140207，0.5 g/粒)均来自市场抽验样品。甲醇为质谱纯;醋酸铵、甲酸均为分析纯;水为超纯水。

2 实验方法

2.1 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm);流动相A 为甲醇，流动相B为10 mmol/L 醋酸铵(含0.1%甲酸)溶液;体积流量0.2 mL/min;梯度洗脱 (见表1);柱温35 ℃;检测波长260 nm (波长范围190 ～400 nm);进样量1 μL。

2.2 质谱条件 电喷雾离子化正离子检测方式(ESI+)，质荷比范围 m/z 50 ～700，干燥气温度(Gas Temp)350 ℃，干燥气体积流量(Gas Flow)10 L/min，毛细管电压3.5 kV，干燥气压力45 psi(1 psi=6.895 kPa)，碎裂电压(Fragmentor)135 V，采用全扫描一级质谱、选择离子二级全扫描质谱检测方式。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取土霉素对照品60.12 mg、马来酸氯苯那敏对照品3.07 mg、醋酸泼尼松对照品3.23 mg，用甲醇溶解于50 mL 量瓶中作为混合贮备液。取5 mL 定容至20 mL，作为混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取10 粒样品内容物，混匀，研细，精密称取约0.2 g 置100 mL 量瓶中，加入甲醇约80 mL，超声提取20 min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，滤液稀释一定倍数后用于UPLC、MS、MS/MS 分析。

3 实验结果

3.1 土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松对照品色谱及质谱行为 采用正离子检测方式对土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松对照品溶液进行UPLC、MS、MS/MS 分析，优化质谱毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂气流速、脱溶剂温度、碰撞能量等参数。表2 给出了3 个成分的一级质谱准分子离子和二级质谱的碰撞能量，推测3 个成分质谱裂解途径如图1 所示。

表2 准分子离子及碎片离子Tab.2 Parent ions and daughter ions

3.2 样品的定性检测 将“2.3.2”项下稀释后的样品在相同色谱和质谱条件下进行UPLC、MS、MS/MS 分析， “咳喘王胶囊”和“清肺胶囊”均检测到与土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松3种对照品相同的保留时间峰，且紫外光谱图也相同，相应图谱见图2、图3。结合质谱的准分子离子峰及二级碎片离子峰信息(见图4、图5)，可以确定所测样品中非法添加了土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松3 种化学药。

图2 混合对照品、咳喘王胶囊、清肺胶囊总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of mixed reference substances，Kechuanwang Capsules and Qingfei Capsules

图3 混合对照品DAD 紫外光谱图Fig.3 DAD UV spectra of mixed reference substances

图4 混合对照品一级质谱图Fig.4 Full MS spectra of mixed reference substances

图5 混合对照品二级质谱图Fig.5 Full MS2 spectra of mixed reference substances

3.3 方法学考察

3.3.1 线性关系考察 精密量取混合对照品的贮备液1、3、5、7、9 mL 置20 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀即得。在“2.1”色谱条件下进行测定，以峰面积为纵坐标(Y)，溶液的质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)绘制标准曲线，得到土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的线性回归方程分别为Y=2.742 1X-3.955 0，r=0.999 9，线性范围为60.12 ～541.08 μg/mL;Y=3.792 0X-1.401 5，r=0.999 8，线性范围为3.07 ～27.63 μg/mL;Y=6.225 5X - 2.498 5，r = 0.999 7，线性范围为3.23 ～29.07 μg/mL。结果表明，线性关系良好。

3.3.2 仪器精密度试验 取“2.3.1”项下的混合对照品溶液，连续进样6 次，土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的色谱峰面积RSD 分别为0.69%、0.53%、0.62% (n =6)。结果表明，仪器的精密度良好。

3.3.3 重复性试验 精密称取“咳喘王胶囊”6份，按照“2.3.2”项下方法制备供试液，在“2.1”项色谱条件下进样，测定峰面积，外标法计算平均含有量(mg/粒)分别为土霉素58.10、马来酸氯苯那敏2.19、醋酸泼尼松2.25，RSD 分别为1.92%、2.04%、1.80%。结果表明，本法测定土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松含有量的重复性良好。

3.3.4 稳定性试验 取“2.3.2”项下的供试品溶液，分别在配制后0、1、2、4、6 h 测定，根据土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的色谱峰面积，按外标法计算RSD 分别为1.6%、1.3%、0.97% (n =5)。结果表明，供试品溶液在6 h 内稳定性良好。

3.3.5 检出限与定量限 对照品溶液逐级稀释后测定，土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的检测限 (S/N = 3)分别为0.904、0.206、0.049 μg/mL;土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的定量限(S/N =10)分别为2.715、0.412、0.146 μg/mL。

3.3.6 回收率试验 精密称取样品约0.1 g，分别加入约相当于相应成分80%、100%、120%量的对照品3 份，按照“2.3.2”项下的方法制备供试液，在“2.1”项条件下进样，记录色谱峰面积，按外标法计算。土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的平均回收率分别为98.6%、113.9%、99.6%，RSD 分别为0.96% (n=9)、1.6% (n=9)、1.3% (n =9)。结果表明，本方法测定土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的回收率良好。

4 样品测定

将样品按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，测定咳喘王胶囊中非法添加土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的色谱峰面积，按外标法计算。该胶囊中非法添加土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的平均含有量(mg/粒)分别为57.82、2.17、2.20 (n =3);清肺胶囊中非法添加土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的平均含有量 (mg/粒)分别是47.82、2.04、2.38 (n=3)。

5 讨论

5.1 流动相的优化 本实验考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-10 mmol/L 的乙酸铵(0.1% 甲酸)溶液体系为流动相对目标化合物分离，结果表明土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松三成分虽能在乙腈-水体系中分离，但灵敏度、峰形不及甲醇-水体系;且甲醇较经济，相同的保留时间所需要的甲醇比例大。相对水作为流动相，乙酸铵的加入提高了化合物的响应;加入0.1%甲酸有助于化合物的离子化，可获得较优色谱分离效果和质谱信号响应，得到的峰形对称、尖锐，且基线平稳。所以，采用甲醇-10 mmol/L 的乙酸铵(0.1%甲酸)溶液体系作为流动相。

5.2 色谱柱的选择 笔者对Agilent SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Agilent Extend-C18(2.1 mm ×50 mm，1.8 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse plus-C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)5 根色谱柱进行考察，结果Agilent SB-C18色谱柱能使待测的3 种组分均有适宜的保留，且各组分的分离效果较佳。

5.3 检测波长的确定 国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件(批件号2009031)［14］中醋酸泼尼松和马来酸氯苯那敏的检测波长设定为225 nm，文献报道土霉素的检测波长为280 nm［12］。本实验共设计了225、240、260、265、280 nm 5 个检测波长，通过二极管阵列检测器在190 ～400 nm 波长范围内扫描，在260 nm 处3 种成分有比较理想的色谱峰响应值，因此选择260 nm 作为三者的检测波长。

5.4 3 种非法添加物的确认 “咳喘王胶囊”和“清肺胶囊中”中都以麝香、川贝、甘草、苦参、地龙等作为主要原料，有止咳平喘功效。按照国家食品药品监督管理局《药品检验补充检验方法和检验项目批准件》，对疑似出现不良反应的止咳平喘类胶囊进行检验，通过液质联用法检出其非法添加醋酸泼尼松和马来酸氯苯那敏。对准分子离子m/z 461 未知物质色谱峰，通过数据库筛查发现土霉素的［M + H］+为461，且匹配值 (Score 98.89)很高，笔者怀疑其添加了土霉素。采用土霉素对照品与样品进行UPLC-DAD、MS、MS/MS分析，最终确证咳喘王胶囊、清肺胶囊中均非法添加土霉素。

醋酸泼尼松为糖皮质激素类药物，与大剂量抗菌素合用有良好的抗炎、抗毒及促进症状缓解等作用;马来酸氯苯那敏用于如过敏性鼻炎、哮喘、过敏性皮炎等各种过敏性疾病的抗组胺类药;土霉素为广谱抗生素，对革兰阳性菌、革兰阴性菌都有抑制作用，对衣原体、支原体等也有一定的抑制作用。笔者认为添加者想通过在咳喘王胶囊、清肺胶囊中添加土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松三种成分对患者达到“强效、速效”治疗哮喘的效果。

6 结论

本实验利用UPLC/Q-TOF/MS 技术将色谱的高分离性能和质谱的高鉴别能力相结合检测“咳喘王胶囊”和“清肺胶囊”，结合保留时间、DAD 紫外光谱图、一级质谱、二级质谱碎片信息等4 方面信息以及数据库，使得检测结果得以确证，最终建立了同时检测止咳平喘中药制剂中非法添加土霉素、马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松的分析方法。本方法还适用于筛查中药制剂是否掺入其他8 种止咳平喘类化学药(茶碱、磺胺甲噁唑、醋酸泼尼松、地西泮、马来酸氯苯那敏、盐酸苯海拉明、枸橼酸喷托维林、磷酸苯丙哌林)，故此方法的建立能够给科研工作者及检测人员提供一定的参考价值，同时对打击止咳平喘类中药制剂非法添加西药成分的制假行为，保证人民群众用药安全具有现实意义。

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