不同干燥方式对地龙提取物中17种氨基酸的影响

2015-01-13石召华黄文芳陈立军刘享平

中成药 2015年5期

关键词：硫氰酸冷冻干燥真空

石召华，黄文芳，陈立军，刘享平

（1.湖北李时珍药物研究院，湖北武汉430061；2.武汉爱民制药有限公司，湖北鄂州436070；3.湖北省天然组分药物工程技术研究中心，湖北鄂州436070）

不同干燥方式对地龙提取物中17种氨基酸的影响

石召华1，2，黄文芳1，3，陈立军1，2，刘享平2*

（1.湖北李时珍药物研究院，湖北武汉430061；2.武汉爱民制药有限公司，湖北鄂州436070；3.湖北省天然组分药物工程技术研究中心，湖北鄂州436070）

目的研究不同干燥方式对地龙提取物中17种氨基酸的影响，确定其适宜的干燥方法。方法采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色谱法，测定并比较真空冷冻干燥、真空减压干燥和微波干燥3种方式所得地龙干燥样品以及未经干燥样品中的17种氨基酸的量。结果冷冻干燥所得产品中氨基酸的损失率小，含水量低，外观色泽和形态均较优；谷氨酸、组氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸这6种氨基酸在真空减压干燥下的损失率分别为5.01%、9.41%、7.45%、13.19%、4.99%和6.59%；除门冬氨酸和脯氨酸外，其他15种氨基酸在微波减压下的损失率均在22.65%～55.97%之间。结论温度是地龙氨基酸提取液干燥过程中的重要因素。真空冷冻干燥对地龙提取物中的17种氨基酸的影响较小，是地龙提取物较适宜的干燥方式。

地龙；氨基酸；柱前衍生；异硫氰酸苯酯；干燥方式；冷冻干燥

地龙，又称蚯蚓，是常用中药之一，其性味咸寒，有清热熄风降压平喘通络利尿之功效［1］。研究发现地龙氨基酸含有量及组成与其药理作用有很大关系［2-3］。广地龙中含有丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸等多种氨基酸，成分复杂［4］，采用不同方法对地龙提取物进行干燥时，氨基酸的量可能差异较大。本研究采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色谱法，对地龙提取液进行真空冷冻干燥、真空减压干燥和微波干燥3种不同干燥方法所得地龙提取物中的17种氨基酸进行测定，结合含水量测定和产品外观质量等，研究不同干燥工艺对地龙中氨基酸类化学成分的影响，优选地龙氨基酸提取物的干燥工艺。

1 实验材料与仪器

1.1 材料地龙药材购自亳州中药材市场，产地广东，批号20131106，经湖北省药学会中药鉴定分会陈科力教授鉴定为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥体。

1.2 仪器 RE-5298旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；LYO-0.5（CIP）真空冷冻干燥机（上海东富龙科技股份有限公司）；DZG-6020型真空减压干燥箱（上海森信实验仪器有限公司生产）；HWZ-5B箱式微波真空干燥机（广州兴兴微波能设备有限公司）；MA45红外水分测定仪（德国赛多利斯公司）；安捷伦1260液相色谱仪系统（美国安捷伦公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司）。

1.3 试剂三水合醋酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；冰醋酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（HPLC级，美国TEDIA试剂）；正己烷（HPLC级，美国TEDIA试剂）；实验用水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团）；17种混合氨基酸对照品溶液（门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸）、衍生试剂A（异硫氰酸苯酯-乙腈溶液）和衍生试剂B（三乙胺-乙腈溶液）均来自月旭公司氨基酸分析包。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［5-6］Ultimate Amino Acid AAA氨基酸分析柱（5μm，4.6 mm×250 mm，月旭材料科技有限公司）；体积流量1.0mL/min；柱温40℃；进样量5μL；检测波长254 nm。流动相A为0.1 mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）-乙腈（93∶7）；流动相B为水-乙腈，二元梯度洗脱，洗脱程序见表1。混合对照品及样品的HPLC图见图1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 样品的制备

2.2.1 对照品溶液的制备取Welch公司17种氨基酸对照品溶液用水稀释至原来浓度的1/10倍作为对照品。Welch公司17种氨基酸对照品溶液稀释10倍后，门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的浓度均为0.25 mol/L，胱氨酸的浓度为0.125mol/L。

2.2.2 地龙药材提取物的制备称取地龙粗粉10 g，加水100 mL，浸泡60 min，超声处理（250 W，50 Hz）60 min，12 000 r/min离心10min，取上清液，备用。

2.2.3 地龙氨基酸提取物的不同干燥样品的制备以含水量低于5%为干燥标准，精密量取地龙药材提取物，分别采用不同方式干燥地龙氨基酸组分提取物。

2.2.3.1 真空冷冻干燥工艺预冻温度为-40℃，时间3 h；升华干燥温度20℃，升温时间2 h，时间为8 h；解析温度为40℃，时间为8 h；工作压力10～30 Pa。

图1对照品与样品HPLC图

2.2.3.2 真空减压干燥工艺温度控制在40℃左右，真空度控制在-0.09 MPa，提取液的相对密度控制在1.25左右，时间为4 h。

2.2.3.3 微波干燥工艺将金属温度探头置于样品表面测量温度，调节一定的微波功率进行辐射（通过间隙辐射控制温度在40℃以下）。

2.2.4 衍生步骤分别将A、B两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍，精密量取 “2.2.1”项所制备对照品溶液1 mL，置于试管中，加入稀释后的A溶液0.5 mL和稀释后的B溶液0.5 mL，涡旋混合1 min，在50℃水浴中加热45min，取出，加入正己烷溶液1 mL，振摇，涡旋混合1 min，静置30 min，吸取下层澄清液体，用孔径为0.45μm有机滤膜滤过，即得。供试品溶液稀释到适宜浓度后的衍生步骤与对照品相同。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察精密量取Welch公司17种氨基酸对照品溶液用水稀释至不同的浓度。分别取其1mL，按照“2.2.4”项下的衍生步骤和 “2.1”项下色谱条件进行操作，再注入液相色谱仪，进样量5μL，记录各氨基酸峰面积。分别以氨基酸对照品峰面积为纵坐标Y，以对照品进样量（ng）为横坐标X，进行线性回归，计算其回归方程，见表2。17种氨基酸的相关系数在0.999 7～0.999 9之间，表明17种氨基酸的线性关系良好。

2.3.2 精密度试验取 “2.2.4”项下的衍生化后供试品溶液，按照上述色谱条件连续进样5次。17种氨基酸的峰面积RSD值在0.12%～3.4%之间，实验结果表明仪器精密度良好。

表2 17种氨基酸线性关系及线性范围

2.3.3 稳定性试验取 “2.2.4”项下的制备的同一份衍生化后供试品溶液，在上述色谱色谱条件下，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，进行测定。17种氨基酸的峰面积RSD值在0.17%～2.8%之间。表明供试样品在24 h内稳定。

2.3.4 重复性试验取 “2.2.4”项下的平行制备的5份衍生化后供试品溶液，按照上述色谱条件进行测定。17种氨基酸的峰面积RSD值在0.41%～3.6%之间，实验结果表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验精密量取已知含有量的地龙氨基酸提取液5 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入稀释后的氨基酸混合对照品溶液5 mL，用纯净水稀释到刻度。按照“2.2.4”项下衍生步骤及 “2.1”项下色谱条件进行测定并计算回收率。结果，17种氨基酸的的回收率均在94.6%～103.9%之间，RSD在1.2%～4.6%之间，表明此方法回收率良好。

2.4 干燥产品的外观及含水量测定分别采用真空减压干燥、真空冷冻干燥和微波干燥3种方式对地龙氨基酸组分提取物进行干燥处理。各干燥产品用MA45红外水分测定仪测定其含水量。结果（见表3）表明，冷冻干燥所得产品含水量较低，外观色泽以及形态较好，且样品复溶性好。

表3 地龙提取物不同干燥方法所得产品外观及含水量

2.5 样品测定分别精密量取地龙氨基酸提取液及其不同干燥样品和混合对照品溶液，按照 “2.1.4”项下的衍生步骤和 “2.3”项下色谱条件进行操作，再注入液相色谱仪，进行测定，计算地龙氨基酸提取液及其不同干燥样品种17种氨基酸的含有量（外标一点法），17种氨基酸测定结果见表4。

表4 地龙提取物不同干燥产品中17种氨基酸的测定结果（x±s）

3 讨论

测定氨基酸的方法有柱前衍生化和柱后衍生化。柱后衍生化法是以茚三酮作为衍生化试剂的离子交换色谱法［7］，需专门的氨基酸分析仪。目前常用的柱前衍生化试剂有邻苯二甲醛（OPA）、6-氨基哇琳基-N-琥珀酰-亚胺基甲酸酯（AQC）、2，4-二硝基氟苯（DNFB）以及异硫氰酸苯酯（PITC）等。OPA不能和仲氨基酸反应［5-6］；AQC的衍生化水解产物会影响分离度［7-8］；DNFB试剂具有强致癌性，且需要在避光和一定的温度条件下才能进行此反应，反应条件苛刻［9］；PITC衍生物单一、稳定，衍生副产物对HPLC测定无干扰，衍生化反应速度快，一、二级氨基酸均可被测定，目前应用较广泛［10-12］，所以本实验采用异硫氰酸苯酯作为柱前衍生化试剂来测定地龙提取液中的17种氨基酸。

本研究采用真空减压干燥、真空冷冻干燥和微波干燥三种常用干燥方法对地龙提取物进行干燥处理，根据所得干燥产品中17种氨基酸的含有量以及含水量和外观情况，优选地龙氨基酸提取物合适的干燥方式。结果表明冷冻干燥所得产品种氨基酸的损失率小，含水量低，外观色泽和形态均较优。17种氨基酸中，对温度较不敏感的氨基酸有门冬氨酸和脯氨酸，3种干燥方式对这两种氨基酸含有量均没有显著性影响。而谷氨酸、组氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸对温度比较敏感，45℃减压干燥下这6种氨基酸的含有量损失率分别为5.01%、9.41%、7.45%、13.19%、4.99%、6.59%。而在微波干燥下，除门冬氨酸和脯氨酸这两种比较稳定的氨基酸外，其他15种氨基酸的含有量损失率均在22.65%～55.97%之间。综上，氨基酸类成分对热较敏感，温度是地龙氨基酸提取物干燥过程中的重要因素。真空冷冻干燥是地龙氨基酸提取物较适宜的干燥方式。

［1］张晓晨.地龙药理与临床研究进展［J］.中成药，2011， 33（9）：1574-1578.

［2］刘亚明，郭继龙，刘必旺，等.中药地龙的活性成分及药理作用研究进展［J］.山西中医，2011，27（3）：44-45.

［3］何琳，龙晓英，谢礼新，等.地龙配方颗粒的质量标准研究［J］.中成药，2007，29（8）：1173-1177.

［4］裴福成，李长新，任桂萍.柱前衍生HPLC法测定地龙中氨基酸的含量［J］.中医药学报，2007，35（3）：26-27.

［5］蔡萍，万丹，肖娟，等.土鳖虫超微粉体中游离氨基酸的测定及指纹图谱研究［J］.中成药，2011，33（10）：1645-1648.

［6］黄哲甦，隋玉荣，李海生，等.异硫氰酸苯酯柱前衍生法测定安尿通中3种氨基酸含量［J］.现代仪器，2005，11（2）：14-15.

［7］Checa-Moreno R，Manzano E，Mirón G，et al.Revisitation of the phenylisothiocyanate-derivatives procedure for amino acid determination by HPLC-UV［J］.J Sep Sci，2008，31（22）：3817-3828.

［8］黄璐敏，詹云丽，黄丹莹，等.2种柱前衍生法测定地龙注射液主要氨基酸的含量［J］.中国医药指南，2012，10（20）：90-92.

［9］吕莹果，张晖，孟祥勇，等.氨基酸分析测定及衍生化方法［J］.粮食与油脂，2009，（07）：35-38.

［10］高晓燕，苏建坤，王雪，等.异硫氰酸苯酯法测定清开灵注射液中氨基酸的含量［J］.北京中医药大学学报，2012，35（8）：554-558.

［11］杨智，阳利龙，祝文兵，等.异硫氰酸苯酯柱前衍生化RP-HPLC法测定人血浆中10种氨基酸的浓度［J］.中国临床药理学与治疗学，2011，16（5）：549-552.

［12］杨菁，孙黎光，白秀珍，等.异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色谱法同时测定18种氨基酸［J］.色谱，2002，20（4）：369-371.

R284.1

：B

：1001-1528（2015）05-1135-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.049

2014-07-18

国家十二五重大新药创制科技重大专项经费资助项目（2014ZX09201-022-03）；湖北省重大科技创新专项经费资助项目（2013ACC005）

石召华（1975—），男，博士，高级工程师，从事中药制剂研究。Tel：（0711）3818216，E-mail：whimyf@163.com