金匮肾气丸温补肾阳药理作用的实验研究

付正丰， 龚 明， 苗家伟， 岳秀永， 陈春梅， 严 磊， 陈 华*

（1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆404120；2.重庆医科大学，重庆400016）

金匮肾气丸温补肾阳药理作用的实验研究

付正丰1， 龚 明1， 苗家伟1， 岳秀永1， 陈春梅1， 严 磊2， 陈 华1*

（1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆404120；2.重庆医科大学，重庆400016）

目的以下丘脑-垂体-性腺轴为基础，探究金匮肾气丸对肾阳虚大鼠的药理作用，探讨其温补肾阳的作用机制。方法用氢化可的松建立肾阳虚模型大鼠，60只，随机分为6组，造模后连续灌喂给药30 d；分别于给药第15天、第30天进行强迫负重游泳实验；第30天，眼球取血，放射免疫分析法检测血清睾酮 （T）、雌二醇 （E2）的水平；采用RT-PCR法检测各组大鼠下丘脑、垂体和靶腺（睾丸）钙调蛋白（CaM）mRNA的表达。结果与模型组比，金匮肾气丸可明显提高肾阳虚模型大鼠的负重游泳时长 （P＜0.05），给药20 d后其体能趋于正常；金匮肾气丸可明显降低血清中雌二醇水平及升高睾酮水平 （P＜0.05）；金匮肾气丸可明显降低下丘脑、垂体、睾丸中CaMRNA的表达 （P＜0.05）。结论金匮肾气丸具有明显的温补肾阳作用，可通过调节机体下丘脑-垂体-性腺轴中钙调蛋白基因表达，改善肾阳虚大鼠激素水平，逆转肾阳虚状态。

金匮肾气丸；下丘脑-垂体-性腺轴；雌二醇；睾酮；钙调蛋白

金匮肾气丸是中医温补肾阳的经典基本方剂，常用于肾阳不足、腰膝酸冷、肢体浮肿、小便不利、生殖功能减退等肾阳虚衰证。研究发现，肾阳虚时细胞免疫、体液免疫、补体系统及网状内皮细胞吞噬功能都有不同程度的降低，而通过补肾可获得明显提高，有效纠正机体免疫功能，使之恢复平衡的生理状态。本研究以动物整体为对象，依托下丘脑-垂体-性腺轴对机体的调控作用进行研究，探讨金匮肾气丸温补肾阳药理作用的机制。

1 材料方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠，体质量 （200±20）g，60只，购自重庆医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（渝）2010-0001。

1.2 实验仪器 Access2化学发光免疫分析仪，美国Beckman公司生产；SN-69全自动双探头放射免疫γ计数仪，上海原子核研究所日环仪器一厂生产；10001-Series Thermal Cyclers PCR仪，美国BioRad公司生产；飞鸽TDL-40B型台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品。

1.3 实验药品与试剂 金匮肾气丸 （水蜜丸）由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产，规格为每100粒重 20 g，批准文号国药准字 Z11020054，产品批号12030553。大鼠T（睾酮）放射免疫试剂盒及大鼠E2（雌二醇）放射免疫试剂盒，购自上海生工生物股份有限公司；TRIZOL RNA提取试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；氢化可的松注射液，由吉林长白山药业集团股份有限公司生产，批准文号国药准字H22021471，产品批号20120301；甲基睾丸素片，由天津力生制药股份有限公司生产，批准文号国药准字 H12020153，产品批号12010618。

1.4 动物模型的建立及给药 60只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、阳性药物 （睾酮）组、金匮肾气丸低、中、高剂量组，每组10只。除正常组注射生理盐水外，其他各组大鼠每日中午右腿按25 mg/kg皮下注射氢化可的松，连续4 d，建立肾阳虚大鼠模型，随后30 d内给予氢化可的松，同时给予对应的治疗药物：金匮肾气丸低剂量 （0.5 g/kg）、中剂量 （1.0 g/kg）、高剂量 （2.5 g/kg）；阳性药物组 （甲基睾酮片）（0.5 g/kg）。将各组药物以5‰的CMC水溶液配制为10 mL/kg的给药剂量，灌胃给药，2次/d，连续治疗30 d。

1.5 负重游泳实验 所有大鼠于实验前进行一次游泳训练，其后在接受药物治疗的第15天、第30天进行负重游泳实验，尾部上三分之一处负其体质量10%的铅线记录大鼠游泳力竭时间。力竭标准为大鼠全部身体沉入水下5秒不能浮出水面。

1.6 大鼠血清激素水平的检测 第30日晚灌胃给药后，禁食12 h。眼球取血，约3.5mL，断头处死后迅速取下丘脑、垂体、性腺 （睾丸）称定质量，置液氮中固定，后转入-80℃低温冰箱保存，用于基因检测。血清采用SN-69全自动双探头放射免疫γ计数仪，按试剂盒操作说明检测大鼠血清E2、T水平。

1.7 大鼠下丘脑-垂体-性腺轴钙调蛋白的基因表达检测

引物设计，从GeneBank中查出大鼠CaM基因和β-actin的mRNA序列，利用美国PE公司引物设计软件Primer Express设计转移性引物，大鼠CaM正向引物5＇-GAT AAG GAC GGC AATGGC TAC A-3＇；反向引物5＇-CGA TGTCTG CTTCCC TGA TCA T-3＇。扩增片段为115 bp。β-actin（内参对照）正向引物5＇-CCT GTG GCA TCC ATG AAA CTA C-3＇；反向引物5＇-CTTCTGCATCCTGTC AGCGAT-3＇。扩增片段为134 bp。

取冻存组织 （下丘脑、垂体、睾丸）约10 mg，组织匀浆后按TRIZOL试剂盒说明书操作，提取总RNA。

逆转录：cDNA的合成，在50μL取2μL RNA，加入逆转录反应体系（TaqMan Buffer 5μL，1.25 u/μL Reverse Transcritase 1.25μL，0.4 u/μL Rnase Inhibitor 1μL，dNTP mixture 10μL，5.5 mmoL/L MgCL211μL，2.5μmoL/L Oligod 2.5μL，总RNA 5μL）中。震荡混匀，于25℃孵育10min，48℃逆转录30min，95℃逆转录反应灭火5min。

PCR扩增：取逆转录产物5μL，加入20μL扩增反应体系（SYBR PCR Buffer 2.5μL，MgCl23μL，dNTPmixture 2μL，AmpliTaq Gold 0.125μL，各上下游引物0.5μL）中，95℃，变性5min，50℃退火2min，72℃延伸5min，进行36个循环。PCR产物分析，根据各组PCR产物的Ct值，计算每一样品和其内参对照相应含量。1.8 统计学分析 实验数据均以x±s表示，分析采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 金匮肾气丸对肾阳虚大鼠强迫游泳时间的影响 与正常组比较，模型组强迫游泳时间明显缩短 （P＜0.05）；治疗15 d，与模型对照组比较，阳性药物组及金匮肾气丸中、高剂量组差异均有统计学意义 （P＜0.05）。治疗30 d，与模型对照组比较，金匮肾气丸低、中剂量组差异均有统计学意义 （P＜0.05），金匮肾气丸高剂量组有明显差异（P＜0.01）；金匮肾气丸高剂量组与阳性药物组比较差异有统计学意义 （P＜0.05）。见表1。

表1 金匮肾气丸对肾阳虚大鼠强迫游泳时间的影响 （x± s，n=10）

2.2 金匮肾气丸对肾阳虚大鼠血清激素水平的影响 模型对照组血清中 E2激素水平明显高于正常对照组 （P＜0.01）。金匮肾气丸低、中剂量组血清中E2激素水平低于模型对照组，差异有统计学意义 （P＜0.05），高剂量组明显低于模型对照组 （P＜0.01）。同时模型对照组中血清T水平明显低于正常对照组，差异有统计学意义 （P＜0.01）。金匮肾气丸低剂量组血清中T水平高于模型对照组，差异有统计学意义 （P＜0.05），中、高剂量组明显高于模型对照组 （P＜0.01）。见表2。

表2 金匮肾气丸对肾阳虚大鼠血清激素水平的影响 （x± s，n=10）

2.3 金匮肾气丸对下丘脑-垂体-性腺轴CaMmRNA的表达

模型对照组下丘脑组织CaMmRNA的表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。金匮肾气丸中、高剂量组下丘脑组织CaMmRNA的表达明显降低，与模型对照组相比，差异有统计学意义 （P＜0.05）。见表3。

表3 金匮肾气丸对肾阳虚大鼠下丘脑CaMMRNA表达的影响（x±s，n=10）

模型对照组垂体组织CaMmRNA的表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。模型对照组与阳性药物组、金匮肾气丸低、中剂量组比较CaMmRNA的表达无明显差异 （P＞0.05）。金匮肾气丸高剂量组垂体组织CaMmRNA的表达与模型对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 金匮肾气丸对肾阳虚大鼠垂体CaMMRNA表达的影响（x±s，n=10）

模型对照组睾丸组织CaMmRNA的表达明显高于正常对照组，差异均有统计学意义 （P＜0.05）。金匮肾气丸中、高剂量组睾丸组织CaMmRNA的表达明显低于模型对照组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。见表5。

表5 金匮肾气丸对肾阳虚大鼠睾丸CaMMRNA表达的影响（x±s，n=10）

3 讨论

中医认为，肾为先天之本，五脏阳气之根［1］。中医学所讲的 “肾”的概念，非现代医学中单纯的解剖学概念，是由肾、命门、膀胱、骨髓、耳窍、二阴及其所属的经络共同组成的 “肾系统”。中医学中所论述的 “肾藏精”、“主骨生髓”、“肾主水”、“肾主纳气”等肾的功能，实指整个 “肾系统”的功能，是神经、内分泌、泌尿、生殖等一系列相关生理功能的概括。对于肾阳虚的大量实验研究表明，运用氢化可的松建立肾阳虚模型是较为经典的造模方法，符合中医的证［2］。肾阳虚的动物会出现一些未老先衰的症状如体质量下降、耐力低下、性能力减弱、精神萎靡不振、反应迟钝等一系列症状［3］。金匮肾气丸主要由熟地、山药、山茱萸 （酒炙）、茯苓、牡丹皮、泽泻、桂枝、附子 （制）组成，辅料为蜂蜜，具有温补肾阳、化气行水之功效。方中熟地滋肾填精，山茱萸补肝脾而益精血，山药健脾补虚，滋精固肾，泽泻清泄肾火，牡丹皮泻阴中之火，使火退而阴生，并能制约山茱萸的温燥性，茯苓淡渗脾湿，与泽泻相配以行肾邪，助山药健脾益精，附子、桂枝益精血助命门，以温阳化气，引火归元。诸药协同，可调整肾肝脾三脏功能，有开有阖，寓泻于补，使补而不腻，泻邪而不伤正。

神经体液调节是机体保持自身稳定、纠正病态的最重要的调节性体系之一。主要有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴、性腺轴及甲状腺轴三组。研究表明，肾阳虚证的病人常出现上述三轴不同环节不同程度的功能紊乱［4-5］，并累及性腺轴、甲状腺轴［6-7］，涉及神经、内分泌、免疫系统等诸系统组织器官多功能的变化，是多器官与多系统相互作用影响的综合表现［8］。其中下丘脑-垂体-性腺轴功能的异常改变直接影响着机体神经、内分泌的调节，因此逆转其功能紊乱的状态，可以从根本上调节血清中激素如雌二醇、睾酮等的表达，从而影响肾上腺皮质、垂体、甲状腺、性腺等器官的组织形态，使其功能相互协调［9］。CaM（钙调蛋白）是一种多功能调节蛋白，主要分布与脑及内分泌器官，并对下丘脑-垂体-性腺轴的分泌功能密切相关。CaM可以作用于下丘脑-垂体-性腺轴的不同环节、不同层次，直接导致不同激素的改变，因而CaMmRNA在各个器官、组织中的协调表达对机体神经内分泌作用具有明显的调控作用［10］。

本研究显示：金匮肾气丸可明显改善肾阳虚大鼠的体能状态，且随着给药剂量及给药时间的延长，其治疗作用更加显著。对肾阳虚大鼠血清中E2及T的激素水平的影响表明，金匮肾气丸可调节机体激素水平，通过逆转抑制性激素E2的水平，并刺激提升激素T的水平，综合改善肾阳虚状态，并且体内状态的改善程度与肾阳虚大鼠血清E2及T的激素水平的变化呈明显的正相关性。金匮肾气丸可增强下丘脑及睾丸CaMmRNA的表达，从而从整体上调控体内激素的协调表达；对垂体CaMmRNA的表达仅在高剂量组有所表现，这也提示其作用较慢，可能有更为复杂的调节过程。实验结果表明：金匮肾气丸可通过调节肾阳虚大鼠的下丘脑-垂体-性腺轴CaM的表达，调控肾阳虚大鼠E2及T激素水平的表达，改变病理状态。但对于CaM介导的信号转导途径及有效化学成分的相关性，有待进一步的研究。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1111-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.043

2014-11-15

重庆市卫生局医学科研项目 （20121096）；重庆市高等教育教学改革研究重点项目 （132128、133309）；万州区科技计划项目 （201203055）

付正丰 （1978—），男，硕士生，讲师，主要从事中西医临床及中药药理学方面研究。Tel：13996539870，E-mail：fuzz06@ 126.com

*通信作者：陈 华 （1964—），男，副教授，主要从事中药药理学方面研究。Tel：（023）58556830，E-mail：mybestdorthy@ hotmail.com