五子衍宗方对环磷酰胺致小鼠肝脏细胞DNA损伤的保护作用

黄威峰， 刘苗苗，2， 袁 丁， 彭 奔， 张长城*

（1.三峡大学医学院，湖北宜昌443002；2.三峡大学化学与生命科学学院，湖北宜昌443002）

五子衍宗方对环磷酰胺致小鼠肝脏细胞DNA损伤的保护作用

黄威峰1， 刘苗苗1，2， 袁 丁1， 彭 奔1， 张长城1*

（1.三峡大学医学院，湖北宜昌443002；2.三峡大学化学与生命科学学院，湖北宜昌443002）

目的研究五子衍宗方对环磷酰胺（CTX）诱导的小鼠肝脏细胞DNA损伤的保护作用。方法将BALB/c小鼠随机分为正常对照组，模型组，五子衍宗方低、高剂量组，每组10只。五子衍宗方组预给药一周之后，除正常对照组之外，其余各组注射CTX（100 mg/kg）隔天给药共3次，末次注射CTX 12 h后处死小鼠。检测小鼠的肝脏指数，血清中丙氨酸转氨酶 （ALT）和天冬氨酸转氨酶 （AST）活力。硫代巴比妥酸法检测肝脏中丙二醛 （MDA）的量，ELISA检测肝脏中8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的量，单细胞凝胶电泳技术检测肝脏细胞的DNA损伤。结果五子衍宗方能够升高小鼠的肝脏指数，降低ALT、AST的活力，降低肝脏中的8-OHdG、MDA的量，五子衍宗方组均可以使小鼠Olive尾矩、尾长、尾距和尾部DNA%降低。结论五子衍宗方能拮抗CTX造成的小鼠肝脏细胞的DNA损伤，提高肝脏的抗氧化能力。

五子衍宗方；环磷酰胺；DNA损伤；氧化损伤

环磷酰胺 （CTX）是临床上广泛使用的烷化剂类抗肿瘤药和免疫抑制剂。CTX在体外没有烷化活性，需在体内经肝脏的P-450混合功能氧化酶代谢生成具有烷化活性的4羟基环磷酰胺、磷酰胺氮芥、丙烯醛和大量的活性氧自由基。磷酰胺氮芥和丙烯醛能够与DNA交联，代谢产生的自由基也会和DNA发生结合，引起DNA单双链的断裂，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，最终导致细胞的死亡。CTX在临床上有广泛的应用，但其同时也会对正常的细胞表现出严重的毒性，在用CTX治疗的病人中出现二次癌症的几率非常高，国际癌症研究机构（IARC）把CTX作为致癌物。CTX的临床应用因对正常细胞的毒性而被限制，因此减少CTX引起的正常细胞的DNA损伤显得非常重要［1］。

五子衍宗方是由菟丝子、枸杞子、五味子、车前子、覆盆子五味中药组成，药理研究发现五子衍宗丸具有抗自由基、抗衰老、增强免疫力等功效。本课题组前期研究发现，五子衍宗方具有提高环磷酰胺模型小鼠免疫功能、增强抗氧化损伤能力的药理作用，对小鼠免疫低下、骨髓抑制、生精障碍等都有较好的防治作用。进一步研究显示，五子衍宗方可提高环磷酰胺小鼠体内的抗氧化能力，降低小鼠血浆、睾丸组织中MDA水平，增加SOD活力，提示五子衍宗方通过抗氧化损伤来拮抗环磷酰胺毒性［2-3］。近期研究证明，五子衍宗方、菟丝子和枸杞子可以减少自由基，提高机体的抗氧化能力，减少外周血白细胞线粒体的DNA缺失，保护老年大鼠骨骼肌线粒体DNA的损伤，说明五子衍宗方、菟丝子和枸杞子对DNA氧化损伤具有良好的保护作用［4-5］。但五子衍宗丸能否拮抗环磷酰胺造成的肝脏细胞DNA损伤仍有待进一步研究。

1 材料

1.1 实验动物 8～9周龄的SPF级BALB/c种小鼠，体质量22～25 g，由湖北省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2008-0005。在相对湿度55%～65%，温度 （20±2）℃的环境下分笼饲养。

1.2 药品 MDA、考马斯亮蓝试剂盒购自南京建成生物工程研究所。环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司。五子衍宗方由400 g枸杞子、400 g菟丝子、200 g覆盆子、100 g车前子、50 g五味子组成。按照传统方法煎取，浓缩至浸膏，提取率为18.8%。

1.3 仪器 稳流可调式电泳仪 （北京六一仪器厂），BX51型Olympus荧光显微镜并配有CCD摄像装置（日本），紫外分光光度计。

2 方法

2.1 分组和给药方法 40只雄性BALB/c小鼠，随机分为空白组、模型组、五子衍宗方低、高剂量组每组10只。五子衍宗方组预给药一周之后，除空白对照组腹腔注射生理盐水，其余各组注射CTX100 mg/kg隔天给药共3次，末次注射环磷酰胺12 h后处死小鼠。

2.2 指标检测

2.2.1 小鼠肝脏指数的测定 末次给药12 h后称定质量，处死小鼠，迅速取出肝脏，用生理盐水洗净之后，经滤纸擦去表面的水分并称定质量，以肝脏质量 （mg）/体质量（g）来计算肝脏指数。

2.2.2 小鼠血清中生化指标的测定 各组小鼠取血后静置30min，3 500 r/min离心10 min，常规分离血清，送至宜昌市中心医院检测血清ALT、AST水平。

2.2.3 肝脏中MDA和8-OHdG的测定 取0.1 g肝脏组织用PBS洗两次，加入9倍的生理盐水，倒入玻璃匀浆管中，在冰上匀浆5min，将组织匀浆以3 000 r/min离心15 min，弃下面的沉淀留上清。按照说明书，用比色法测定肝脏中MDA和组织中蛋白的水平，ELISA法检测肝脏匀浆中8-OHdG水平。

2.2.4 碱性单细胞凝胶电泳 取0.1～0.3 g肝脏组织，加1 mL PBS用剪刀剪碎，200尼龙网过滤，用细胞计数板计数，调整细胞密度至1×106个/mL。在载玻片上粘上小玻璃条制成微电泳槽，第1层胶是将PBS配制的1%正常熔点的琼脂糖煮沸后取100μL铺在微电泳槽内，于4℃固化5 min。第2层胶是将100μL于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点的琼脂糖与100μL的肝脏细胞悬液混匀后加到第1层胶上，4℃固化5 min。将载玻片浸入新鲜配制的4℃的裂解液，4℃避光裂解2 h。取出后用蒸馏水冲去多余的盐分，将凝胶载玻片放入电泳槽中，加入4℃预冷的电泳液至盖过胶面2～3 cm，4℃避光解旋20 min。调节至电压25 V，电流300 mA，4℃避光电泳20 min。电泳结束后，将载玻片从电泳槽中取出浸入pH 7.0 Tris-HCl中和液中，中和15 min每5min换液1次。在凝胶上滴加EB（10 μg/L）100μL，2 min后用蒸馏水洗涤2次。将染色好的载玻片放在荧光显微镜的40倍镜下拍照，采用casp彗星分析软件对彗星图像进行分析。选取彗星图像的Olive尾矩、尾距、尾长和尾部DNA%进行分析。

2.3 数据分析 数据经SPSS 13.0软件处理，实验各个指标均用均数 ±标准差表示 （x±s），以单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间差异的比较，以Dunnett-t检验比较两组间均数的差异。

3 结果

3.1 五子衍宗方对小鼠体质量及肝脏指数的影响 模型组小鼠注射CTX以后有4只陆续死亡，其余体质量明显降低，肝脏质量及肝脏指数显著低于正常对照组，五子衍宗方低、高剂量组均可增加小鼠的体质量、肝脏质量及肝脏指数。结果见表1。

表1 五子衍宗方对小鼠体质量，肝脏质量，肝脏指数的影响（x±s，n=6）

3.2 五子衍宗方对小鼠血清中ALT和AST变化影响 模型组中ALT、AST的活力较正常对照组显著升高，五子衍宗方高剂量组可显著降低ALT、AST的活力。结果见表2。

表2 五子衍宗方对小鼠ALT、AST活力的影响（x±s，n=6）

3.3 五子衍宗方对模型小鼠肝脏MDA、8-OHdG水平的影响 与正常对照组比较，模型组中MDA和8-OHdG的水平显著升高。五子衍宗方组能够显著降低CTX引起的小鼠肝脏组织中MDA、8-OHdG水平。结果见表3。

3.4 五子衍宗方对小鼠肝脏DNA损伤的影响 模型组的小鼠肝脏细胞的彗星电泳图像的Olive尾矩、尾距、尾长和尾部DNA%都有明显增加，五子衍宗方低、高剂量组都能明显降低小鼠肝脏细胞的彗星图像的Olive尾矩、尾距、尾长和尾部DNA%。各组的单细胞凝胶图像结果如图1，五子衍宗方对CTX造成的小鼠肝脏细胞DNA损伤的指标的结果见表4。

表3 五子衍宗方对模型小鼠肝脏MDA、8-OHdG水平的影响（x±s，n=6）

图1 肝脏细胞的彗星实验图像

表4 五子衍宗方对小鼠肝脏细胞中O live尾矩、尾距、尾长和尾部DNA%的影响（x±s，n=4）

4 讨论

环鳞酰胺 （CTX）是常用的氮芥类的抗肿瘤药物，常用来治疗各种恶性肿瘤与非恶性肿瘤，也是临床上常用的免疫抑制剂［6］。CTX代谢时会产生大量的活性氧自由基，自由基能够和体内所有的生物分子如脂类，蛋白质，碳水化合物和遗传物质DNA等发生结合，影响体内生物酶的活性，从而影响DNA的正常合成和修复［7-8］。其活性代谢产物磷酰胺氮芥可引起DNA链内和链间的交叉连接，丙烯醛也可以与DNA发生加成，同时丙烯醛也会干扰体内的抗氧化系统，引起氧化应激。研究表明，氧化应激是CTX导致正常细胞及组织DNA损伤的主要原因之一［9］。

肝脏是药物代谢的重要器官，CTX经肝脏的代谢产生活性代谢产物和自由基造成DNA损伤，因此肝脏既是CTX的代谢器官，也是CTX的毒性靶器官。药物性肝损伤的临床分析发现，74例药物性肝损伤研究的患者有23例是肿瘤化疗药物引起的，占31.1% 居首位［10］。临床研究发现CTX能够引起血清中转氨酶轻度升高，肝脏组织中GSH和SOD的活力降低，MDA的水平升高，肝脏组织形态发生变化，胆汁分泌发生异常［11］。Tripathi等研究发现CTX能够降低肝脏中GSH、HO-1和NQO-1的水平，升高MDA的水平，升高P53和P38的蛋白表达，引起彗星实验彗星数目和彗星尾距、尾长和尾部DNA%的增加，引起肝脏细胞氧化应激，DNA损伤和细胞的凋亡［12］。Ibrahim等发现CTX可以增加肝脏中8-OHdG和MDA的水平，增加肝脏细胞的DNA片段的比例，引起大鼠肝脏细胞的氧化应激及DNA损伤［13］。

8-OHdG是由活性氧引起的DNA中鸟嘌呤氧化损伤的产物，在体内稳定存在，是DNA的氧化损伤和突变的标志物，8-OHdG是最终代谢产物，能够稳定的存在，因此检测肝脏组织的8-OHdG，可以检测肝细胞DNA的氧化损伤［14-15］。单细胞凝胶电泳技术具有简便快捷，灵敏度高、重复性好等优点，目前常用的用来检测真核细胞的单细胞的DNA链断裂和修复的研究［16-17］。

本实验结果表明，小鼠注射CTX后，小鼠的体质量、肝脏质量以及肝脏指数显著低于空白对照组，血清中ALT、AST的活力显著降低，肝脏中MDA、8-OHdG的水平显著增加，五子衍宗方组能显著降低模型小鼠的MDA、8-OHdG的水平，说明五子衍宗方能够减轻CTX引起的小鼠肝脏DNA的氧化损伤。通过单细胞凝胶电泳实验我们发现五子衍宗方各组对模型组的Olive尾矩、尾距、尾长和尾部DNA%都有显著提高，表明五子衍宗方能够显著减轻CTX造成的DNA损伤。因此，五子衍宗方能够拮抗CTX引起的肝脏细胞的DNA损伤，其机制可能与五子衍宗方清除CTX代谢过程中产生的自由基，提高机体的抗氧化能力及增强损伤DNA修复的能力有关。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1093-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.038

2014-03-15

国家自然科学基金项目 （81173375）

黄威峰（1989—），男，硕士生，主要从事中药药理方面的研究。E-mail：huangweifeng7120@sina.coM*通信作者：张长城（1973—），男，博士，教授，主要从事中药药理方面的研究。E-mail：greatwall@ctgu.edu.cn