京大戟中大戟二烯醇的HPLC测定
2015-01-13葛秀允张乐林孙立立
葛秀允， 张乐林， 孙立立
（山东省中医药研究院 国家中医药管理局中药蜜制和制炭炮制技术与原理研究重点实验室，山东 济南250014）
京大戟中大戟二烯醇的HPLC测定
葛秀允， 张乐林， 孙立立*
（山东省中医药研究院 国家中医药管理局中药蜜制和制炭炮制技术与原理研究重点实验室，山东 济南250014）
目的改进京大戟饮片的质量控制标准。方法采用薄层鉴别对京大戟进行定性鉴别。建立京大戟饮片中大戟二烯醇的HPLC定量测定方法。同时对其杂质、水分、灰分、浸出物等进行测定。结果京大戟饮片薄层色谱斑点清晰，分离度好。大戟二烯醇在0.39～3.88μg范围内线性关系良好，相关系数为r2=1.000；平均回收率为99.96%，RSD为0.97% （n=6）。结论京大戟饮片建议标准为杂质不得过3.0%；水分不得过8.0%；总灰分不得过7.0%，酸不溶性灰分不得过1.5%；浸出物含量不得低于20.0%；按干燥品计算，含大戟二烯醇 （C30H50O）不得少于0.60%。
京大戟；大戟二烯醇；质量标准；改进
京大戟为大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥根。是临床常用有毒中药，具有泻水逐饮，消肿散结的作用［1］。京大戟主要含有二萜类、三萜类、黄酮类和鞣质类等化学成分［2-9］。具有泻下、利尿、抗肿瘤等作用，其毒性主要表现在对消化系统具有强烈的刺激性作用［10-12］。自 《中国药典》1963年版开始收载京大戟药材质量标准，目前尚缺乏京大戟饮片质量标准，导致假劣京大戟饮片充斥市场。本实验对京大戟饮片质量标准进行研究，为制定京大戟饮片的质量标准提供实验依据，从而规范京大戟饮片的质量，保证临床用药安全有效［13-14］。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters 2690型高效液相色谱仪，Waters 2010色谱工作站，德国Sartorius10-5电子天平，上海必能信B3200S-T型超声波清洗器，硅胶G薄层预制板（青岛海洋化工厂），MILLI-Q超纯水纯化系统。
1.2 试药 乙腈（HPLC，TEDIA公司出品）；磷酸、甲醇、乙酸乙酯、石油醚 （分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；大戟二烯醇对照品（euphol）（中国药品生物制品检定所，批号201108，供含量测定用）。水为超纯水，其他试剂均为优级纯或分析纯。京大戟药材购自山东、湖北、河南、江苏等地，经本院中药资源开发研究室林惠彬研究员鉴定为大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥根。
2 方法与结果
2.1 性状 对收集的10批京大戟药材分别按照《山东省中药炮制规范》京大戟项下制备京大戟饮片。见图1。
通过对10批京大戟饮片对比，确定京大戟形状为：呈不规则长圆形或圆形厚片。片面类白色或淡黄色，纤维性。气微，味微苦涩。
2.2 薄层鉴别试验 取本品粉末1 g，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取大戟二烯醇对照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法 （附录ⅥB）试验，吸取上述3种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚 （60～90℃）-乙酸乙酯 （10∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃显色。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图2。
图2 10批京大戟TLC图谱Fig.2 TLC identification of pieces of Euphorbia pekinensis
2.3 杂质、水分、灰分、浸出物检查 照 《中国药典》2010年版一部杂质检查法 （附录IXA）、水分测定法 （附录ⅨH第二法）、灰分测定法 （附录ⅨK法）对10批京大戟饮片进行检查，结果见表1。
2.4 浸出物测定 对影响京大戟饮片浸出物量的浸出方法进行考察。任取一批饮片，以水和不同体积分数的乙醇为溶剂，分别按照 《中国药典》2010年版一部附录X A项下冷浸法和热浸法步骤制备样品，比较两种方法浸出物的量，根据实验结果确定热浸法作为京大戟浸出物的测定方法。
表1 不同批次京大戟饮片 （生品）杂质、水分、灰分和浸出物Tab.1 IMpurities，moistu re and ashes of pieces of Euphorbia pekinensis in differen t batches
采用 《中国药典》2010年版一部附录X A项下热浸法，对10批京大戟饮片进行了测定，结果见表2。
表2 京大戟饮片浸出物测定结果Tab.2 Extract conten ts of pieces of Euphorbia pekinensis in different batches
2.5 大戟二烯醇测定
2.5.1 色谱条件 汉邦Benetnach C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸 （83∶17）；检测波长203 nm；体积流量1 mL/min；柱温30℃［15-16］。
2.5.2 对照品溶液的制备 大戟二烯醇 （自制，纯度为99.21%），精密称取干燥至恒定质量的大戟二烯醇对照品9.56 mg置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀定容。精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得质量浓度0.095 6 mg/mL的大戟二烯醇对照品溶液。
2.5.3 供试品溶液的制备 取京大戟饮片 （生品）干燥粉末0.5 g（过40目筛），精密称定，置50 ML圆底烧瓶中，精密加入甲醇25 ML，闭塞，精密称定质量。水浴回流提取0.5 h，及时取下，放凉后，闭塞，精密称量，甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
2.5.4 线性关系考察 精密吸取大戟二烯醇对照品溶液2、5、10、15、20μL，按上述色谱条件测定峰面积，以大戟二烯醇的进样量 （μg）为横坐标，色谱峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程y=2×106x+14 461，相关系数r2= 1.000，大戟二烯醇在0.39～3.88μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。结果见图3、图4。
图3 大戟二烯醇高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograMof refrence substance euphol
图4 京大戟饮片HPLC色谱图Fig.4 HPLC chroMatograMof refrence piecesof Euphorbia pekinensis
2.5.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液，按照“2.5.1”项下色谱条件，连续进样5次，测定供试品溶液中的大戟二烯醇的RSD为0.5%，结果表明仪器精密度良好。
2.5.6 重复性试验 取京大戟饮片粉末5份，每份0.5 g，精密称定，按 “2.5.3”项下制备，按照 “2.5.1”项下色谱条件测定，得各样品中大戟二烯醇平均含有量为7.347 mg/g，RSD为1.2%，说明本方法重复性良好。
2.5.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h，按照 “2.5.1”项下色谱条件测定，测得大戟二烯醇峰面积的RSD为0.5%，结果表明，供试品溶液至少在10 h内稳定。
2.5.8 加样回收率试验 按加样回收法，取京大戟药材粉末6份，每份0.25 g，精密称定，分别加入一定量大戟二烯醇对照品，按 “2.5.3”项下供试品溶液制备方法制备，按照 “2.5.1”项下色谱条件进行分析，计算大戟二烯醇的平均回收率为100.0%，RSD为1.0%。表明该测定方法结果准确。
2.5.9 样品测定 取不同批次京大戟饮片0.5 g，精密称定，每批样品平行称取2份，按照供试品溶液制备的方法制备，每一份样品进样2次进行测定。对10个批次的京大戟饮片样品进行测定，测定结果见表3。
表3 京大戟大戟二烯醇测定结果Tab.3 DeterMination results of euphol samples
3 讨论
根据10批次京大戟饮片实验测定结果，按平均值的±20%作为限度制定幅度。暂定京大戟饮片杂质不得过杂质不得过3.0%；水分不得过8.0%；总灰分不得过7.0%，酸不溶性灰分不得过1.5%；浸出物量不得低于20.0%；按干燥品计算，含大戟二烯醇 （C30H50O）不得少于0.60%。
分别采用不同体系、不同比例的流动相及不同色谱柱进行色谱分离，最终确定色谱条件为：汉邦Benetnach C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相系统：乙腈-0.2%磷酸 （83∶17）；检测波长203 nm；体积流量1 ML/min；柱温30℃。分离效果最佳。
以大戟二烯醇为对照品建立的薄层鉴别方法和HPLC定量测定方法，结果显示，该法操作简便、结果可靠、重复性好、专属性强，可用于京大戟饮片中有效成分定性定量测定和质量控制。
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Assay of euphol froMEuphorbia pekinensis
GE Xiu-yun*， ZHANG Le-lin，SUN Li-li*
（Shandong Academy of ChineseMedicine，Processing，State Key Laboratory of Processing Technology and Principleof Honey and Charcoal State Administration of TCMof P.R.China，Jinan 250014，China）
Euphorbia pekinensis Rupr.；euphol；quality standard；improvement
R284.1
：A
：1001-1528（2015）05-1064-04
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.030
2014-06-09
国家中医药管理局中医药行业科研专项项目 （200807039）；国家中医药管理局名全国名老中医药专家冯宝麟传承工作室建设项目
葛秀允，博士，副主任中药师，从事中药炮制机理和工艺研究。Tel：（0531）82949829
*通信作者：孙立立，研究员，从事中药炮制机理和中药新药研究。Tel：（0531）82949829，E-mail：xingerx@163.com
