多指标综合评价法优选苍耳子炒制工艺
2015-01-13宋世伟沈佳瑜王光忠
胡 迪， 安 靖， 李 蒙， 宋世伟， 沈佳瑜， 王光忠*
（1.湖北省中医院药学部，湖北武汉430061；2.武汉市第三医院药学部，湖北武汉430060；3.湖北中医药大学药学院，湖北武汉430065）
多指标综合评价法优选苍耳子炒制工艺
胡 迪1， 安 靖2， 李 蒙3， 宋世伟3， 沈佳瑜3， 王光忠3*
（1.湖北省中医院药学部，湖北武汉430061；2.武汉市第三医院药学部，湖北武汉430060；3.湖北中医药大学药学院，湖北武汉430065）
目的优选苍耳子的炒制工艺。方法以炒制温度和炒制时间为变量，采用均匀实验设计，以稀乙醇浸出物、脂肪油含有量、总酚酸、苍术苷和羧基苍术苷的含有量为评价指标。结果苍耳子的最佳炒制工艺为炒制温度260℃，炒制时间9min。结论该工艺稳定可行，对规范炒苍耳子的炮制工艺具有重要意义。
苍耳子；炒制工艺；均匀设计；多指标综合评价法
苍耳子为菊科植物苍耳XanthiuMsibiricuMPatr.干燥成熟带总苞的果实，具有散风除湿，通鼻窍的功能［1］。主要含有倍半萜内酯、贝壳杉烯苷、酚酸、脂肪油等成分。苍耳子生品有毒，过量使用或炮制不当易导致中毒、甚至死亡［2-3］。苍耳子经炮制后，毒性明显降低［4］。有关研究［5-6］表明苍耳子中水溶性苷类成分，包括苍术苷、羧基苍术苷以及其他苷类衍生物等具有一定毒性。而酚酸类成分，包括绿原酸、新绿原酸、咖啡酸和多种咖啡酰奎宁酸类等是苍耳子发挥药效的主要组分，具有良好的抗菌、抗病毒、消炎、镇痛、止咳和抗肿瘤等生物活性。
现行苍耳子的炮制方法主要为清炒法。但是苍耳子炒制要求仅是外观性状等经验指标，缺乏客观科学的炮制工艺参数。由于直观判断具有主观性以及各地经验或习惯的不同，造成炮制品在质量上有较大差异，从而导致药效及毒性的不同。本实验采用均匀设计和回归分析优化苍耳子炒制工艺，为炒苍耳子科学、规范化生产提供依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 SHIMADZU UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津公司），分析天平（瑞士Metiler Toledo公司），HH-4数显恒温水浴锅 （国华电器有限公司），SK7200HP超声波清洗器 （上海科导超声仪器有限公司），TDL-60B离心机 （上海安亭科学仪器厂），CEM红外线测温仪DT-8812（广州市宏诚集业电子科技有限公司），DELTA320pH计（上海摩速科学器材有限公司），Dianex-P680型高效液相色谱仪 （德国戴安公司），四元泵系统，Dianex-UVD170U紫外检测器，Dianex-chemistation色谱工作站。
1.2 试药 苍耳子采自湖北省随县，经湖北中医药大学鉴定教研室张秀桥教授鉴定为菊科植物苍耳XanthiuMsibiricuMPatr.的干燥成熟带总苞的果实。绿原酸对照品 （购自中国药品生物制品检定所，批号110753-201002）；羧基苍术苷对照品和苍术苷对照品 （自制），经理化性质和光谱数据分析，鉴定其结构，纯度大于98.0%。乙腈为美国Tedia色谱纯，双蒸水 （自制），其他所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 均匀试验设计 苍耳子炒制工艺考虑的因素主要有炒制温度和炒制时间。为了全面考察不同温度、时间对炒苍耳子炮制工艺的影响，试验中每个因素安排10个水平，见表1。以稀乙醇浸出物、脂肪油含有量、总酚酸、苍术苷和羧基苍术苷的量为评价指标。根据因素和水平，选取均匀设计表U1*0（108），由它的使用表可以查到，当因素S=2时，应选用表U*10（108）的1，6列，其偏差D= 0.112 5。试验的因素、水平安排结果见表1。通过非线性回归分析优选最佳炮制工艺。
表1 苍耳子炒制工艺的试验方案Tab.1 Test schedule of fried Xanthii F ructus
2.2 炒制方法 以红外温度计测定锅底的温度，当锅底温度达到设定的温度时，放入100 g净苍耳子药材，不断翻炒，待达到规定的时间后，取出，碾去刺，筛净。放凉后称定质量。
2.3 样品测定
2.3.1 稀乙醇浸出物测定 参照 《中国药典》2010年版一部附录X项下热浸法进行测定，结果见表2。
2.3.2 脂肪油测定 取炒苍耳子粉末 （过三号筛）约2 g，精密称定，置于250 ML圆底烧瓶中，精密加石油醚50 mL（60～90℃），密塞，称定质量，水浴 （70℃）提取4 h，放冷后，取下圆底烧瓶，密塞，再称定质量，用石油醚补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液25 ML，置已干燥至恒定质量的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，与105℃干燥1 h，置干燥器中，冷却30 min，迅速称定质量，计算脂肪油含有量。其结果见表2。
2.3.3 总酚酸测定［7］
2.3.3.1 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇水溶液制成每1 ML含8μg的溶液，即得。
2.3.3.2 供试品溶液的制备 取样品粉末0.10 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，水浴回流加热1 h，放冷后，用50%甲醇补足减失的质量。摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL置10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.3.3.3 不同样品中总酚酸的测定 分别取对照品溶液、供试品溶液，以50%甲醇溶液为参比，于328 nm处测定其吸光度，以绿原酸的量计算各样品中总酚酸的量，结果见表2。
2.3.4 羧基苍术苷和苍术苷的测定［8］
2.3.4.1 色谱条件 Eclipse XDB-C8色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相A相为乙腈，B相为0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液（pH=6.2），梯度洗脱 （0～12 min，11%～15%A；12～30 min，15%～18%A）；体积流量1.0 mL/min；检测波长200 nm；柱温25℃；进样量20μL。
2.3.4.2 对照品溶液的制备 精密称取羧基苍术苷4.32 mg，苍术苷4.24 mg，分别置10 mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述对照品溶液各5 mL，置10 mL量瓶中，摇匀制成每1 ML含羧基苍术苷0.216 mg，苍术苷0.212 mg的混合对照品贮备液。再精密量取混合对照品贮备液5 mL，置10 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，制成羧基苍术苷的质量浓度为0.108 mg/mL，苍术苷0.106 mg/mL作为对照品溶液。
2.3.4.3 供试品溶液的制备 取炒苍耳子粉末约0.5 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入蒸馏水20 mL，超声处理30 min，取出，离心，取上清液用微孔滤膜 （0.45μm）滤过，取续滤液，即得。
2.3.4.4 供试品中羧基苍术苷和苍术苷的测定
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按 “2.3.4.1”项下色谱条件下进行测定，计算各样品中羧基苍术苷与苍术苷的量，结果见表2。
2.4 数据处理 从表2中可以看出羧基苍术苷和苍术苷在炮制后的变化是有相关性的，即羧基苍术苷的量减少，苍术苷的量就增大，所以在综合评价时没有考虑苍术苷的量，以稀乙醇浸出物、脂肪油含有量、总酚酸、羧基苍术苷的量为指标，按公式X=Xij/Xjmax进行转换处理，式中Xij为样品液i中成分j的含有量，Xjmax为10个样品液成分j的最大值。式X为转换值。根据各指标在工艺选择中的主次，给予不同的加权系数，以标准化值加权后求和，见表2。
表2 不同炒苍耳子样品中各成分含有量及转换值Tab.2 Components content and conversion values of test samples of fried Xanthii Fructus
将表1及表2中的Y1值用SPSS16.0软件采用向后剔出法对各因素水平进行多元非线性回归拟合，根据回归方程及其回归系数的显著性检验，筛选出最优回归方程：
Y1=6.648-0.053×T+0.002×T×t+ 0.000 12×T2-0.032×t2，r=0.977。
式中T为炒制温度、t为炒制时间。
方差分析见表3，F0.05（4，5）=6.29，P＜0.05，F检验通过，回归方程有意义。
表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance
苍耳子炮制的主要目的是降毒，只考虑其毒性成分羧基苍术苷的变化时，用SPSS 16.0软件采用向后剔出法对各因素水平进行多元非线性回归拟合，根据回归方程及其回归系数的显著性检验，筛选出最优回归方程：
Y2=-1.302+0.021×T-0.000 57×T×t-0.000 047×T2+0.008×t2，r=0.977。
式中T为炒制温度、t为炒制时间。
方差分析见表4，F0.05（4，5）=6.29，P＜0.05，F检验通过，回归方程有意义。
表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance
为了得到最佳的炮制工艺，其综合评价指标Y1值是越大越好，而毒性指标Y2值是越小越好。两个回归方程显示了Y值大小与各因素的取值均有关，方程中T、T×t、T2、t2的系数符号不同，表明这两个因素与Y值大小的关系比较复杂，从回归方程中可以看出T2对Y值的影响最大，即温度升高，Y1值增大，Y2值减小。但温度过高时，有部分饮片出现了炭化现象。由前面所炮制的饮片，可知选择260℃和280℃炮制饮片效果比较好。当T=260℃，t=8.125 min时，Y1max= 3.092 5；而当T=260℃，t=9.3 min时Y2min=0.564 5；当T=280℃，t=8.75 min时，Y1max= 3.666，而当T=280℃，t=9.98 min时，Y2min= 0.367 2；综合各方面的因素，进行苍耳子炮制工艺的考察试验，见表5。
2.5 考察试验结果及数据处理 按照考察工艺条件，按 “2.2”项下的饮片炮制操作过程，炮制苍耳子饮片，再依 “2.3”项下方法测定，将表中5个指标测定的数据按 “2.4”项下方法进行标准化并加权处理，即得综合评价指标Y1值，见表6。
表5 考察试验水平设计Tab.5 Factors and levels
表6 考察试验各指标成分含有量及标准化处理结果Tab.6 Standardized data ofmarker contents
结果表明，第4号和第5号试验的Y1值较大（4.23，4.24），但饮片已部分炭化。当炒制温度为260℃，炒制时间为9 min时，Y1=4.06，Y2= 0.76，结果与回归方程预期的结果比较相近，综合考虑后选择最优的炮制工艺条件为：炒制温度为260℃，炒制时间为9 min。
2.6 验证试验 为进一步验证所得工艺的可行性和稳定性，按上述筛选出的炒苍耳子的最佳炮制工艺进行验证性试验，以炒制温度为260℃，炒制时间为9 min，平行实验3个，结果见表7。
表7 验证试验结果Tab.7 Results of verification
结果表明，验证试验的综合评价指标Y1＇值，与优选结果的Y1值基本一致。表明优选确定的炒制工艺稳定。
3 讨论
本研究采用均匀实验设计，以稀乙醇浸出物、脂肪油含有量、总酚酸量、羧基苍术苷的量等多指标综合评价，优选出炒苍耳子的炮制工艺为炒制温度为260℃，加热9 min，实现了炮制工艺的客观化、数据化、可控化，经验证试验证明该工艺稳定。
苍耳子中要主要毒性成分为羧基苍术苷和苍术苷，其主要的毒性机制是对线粒体膜外氧化磷酸化的抑制作用，其中羧基苍术苷是苍术苷的10倍［9］。LD50的测定结果也表明羧基苍术苷的毒性明显大于苍术苷的毒性。炒制使羧基苍术苷转化为苍术苷［10］，再进一步降低苍术苷的量，可显著降低苍耳子的毒性。因此，工艺优选时，仅选择羧基苍术苷的量作为降毒效果的评价指标。
多指标综合评价法优选工艺条件的技术参数是均匀设计 （包括正交设计）最常见的手段，与单指标相比，它更能全面、客观、公正地反映实验结果的真实性和准确性。在多指标试验中，若不同指标分别数据处理，则会出现用某一指标评价时，A因素为1水平最优，而用另一指标评价时，则A因素为3水平最优，一项指标好了，另一项指标却差了，出现了矛盾。因此，应采用多指标综合评价。多指标综合评价时，各评价指标的数值大小相近，其测定值不必转换，即可将其直接相加计算综合分。如果差异太大，如浸出物一般为百分之几十，而成分含有量一般为百分之一左右，甚至更低，如直接相加，则浸出物对综合分的影响非常大，那么，最佳工艺也就取决于该值的大小。这时应该将数据进行转换，再将转换值再乘以权重系数，这样突出重要指标的重要作用，使处理后的结果更加科学、合理。
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OptiMization of stir-frying Xanthii Fructus bymulti-indices coMprehensive evaluation
HU Di1， AN Jing2， LIMeng3， SONG Shi-wei3， SHEN Jia-yu3， WANG Guang-zhong3*
（1.Dept.of Pharmacy，Hubei Provincial Hospital of TCM，Wuhan 430061，China；2.Dept.of Pharmacy，Wuhan Third Hospital，Wuhan 430060，China；3.School of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China）
KEY WORDS：Xanthii Fructus；stir-frying；uniforMdesign；multi-indices comprehensive evaluation
R283
：A
：1001-1528（2015）05-1060-05
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.029
2014-06-24
湖北省自然基金项目 （2013CFB065）
胡 迪 （1965—），女，主管药师，从事中药炮制研究。E-mail：495677732@qq.com
*通信作者：王光忠 （1965—），男，教授，从事中药饮片及其制剂物质基础和质量控制研究。Tel：（027）68890231，E-mail：wgzhong4067@sina.com
