桉叶提取物抗菌作用及主要挥发性成分的年度变化

陶 奕， 殷 梦， 张皓冰*

（1.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所；世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心；卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，上海200025；2.上海医药高等专科学校，上海201318）

桉叶提取物抗菌作用及主要挥发性成分的年度变化

陶 奕1， 殷 梦2， 张皓冰1*

（1.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所；世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心；卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，上海200025；2.上海医药高等专科学校，上海201318）

目的分析云南省临沧市永德县10年树龄赤桉、蓝桉和大叶桉的叶片提取物中挥发性成分的含有量变化情况，并研究其抑菌作用。方法连续12个月采摘3种桉叶片，阴干后分别用二氯甲烷和无水乙醇超声提取，对两提取物进行GC/MS分析，并用琼脂平板扩散法测定其抑菌活性。结果蓝桉含挥发性成分量最高，赤桉最低。无水乙醇桉叶提取物的抗菌活性均强于二氯甲烷桉叶提取物，对革兰氏阳性菌的抑制作用均强于对革兰氏阴性菌，但桉叶的主要成分1，8-桉叶油素抑菌活性很弱。结论同一月份3种桉叶提取物以及同一种桉叶不同月份提取物的挥发性成分含有量和抗菌活性均有差异，而且其抑菌成分可能与1，8-桉叶油素相关不大，需作进一步研究。

赤桉；蓝桉；大叶桉；革兰氏阳性菌；革兰氏阴性菌；抗菌作用

致病菌对抗生素广泛产生耐药性一直是临床医学最棘手的难题。寻找新的抗生素，是一项急迫而长期的任务。从1981年到2010年批准上市的1355个新药中，约71%直接或间接来自于天然产物。在1 073个新化学实体 （NCE）小分子药物中，约64%直接或间接地来源于天然产物［1］。因此，从天然产物中筛选结构新颖的抗菌药物，是发现新抗生素的主要途径之一［2］。

桉树是桃金娘科Myrtaceae桉属Eucalyptus植物的统称，起源于澳洲大陆，1890年引种我国，迄今约有300多种［3］。多年以来，已有大量实验证实桉叶精油及有机溶剂提取物对各类细菌有抑制作用，研究范围涉及各种桉树品种［4-5］、桉树的不同部位［6］、不同的提取溶剂［7］及针对不同类别的细菌。桉树品种涵盖了包括蓝桉［8-9］、油桉［6］、二色桉、 综 桉［10］、 尤 曼 桉［11］、 柠 檬 桉［12］、 大 叶桉［13-14］、 赤桉、 托里桉［15-16］、 尾叶桉［17］以及广林9号［7，18］等多种品种，抑制活性试验涵盖了革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌和霉菌等且证实普遍具有活性。如蓝桉精油对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、幽门螺旋杆菌有活性［9，19］；赤桉叶提取物对枯草芽孢杆菌、差异柠檬酸杆菌、大肠杆菌、产酸克雷氏菌、绿脓杆菌、鼠伤寒杆菌具有抗菌活性；大叶桉、柠檬桉、尤曼桉 （A、B）叶片的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和黄瓜枯萎病菌均有抑制作用［4］。大叶桉叶精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用［5］。以及采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮和石油醚分别提取大叶桉叶活性物质，以甲醇和95%乙醇提取物的抑菌作用最为明显［6］。而尾叶桉叶精油对细菌和真菌均有抑菌效果，其中对桔青霉菌抑菌效果最好，对金黄色葡萄球菌的效果次之，对大肠杆菌的抑菌效果最差［16］；广林九号桉叶的水提液、石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取后剩余物对各供试菌株的药敏试验结果显示，有效部位为乙酸乙酯组分、正丁醇组分及萃取后剩余组分［7］。其桉叶精油对细菌和霉菌的抑菌效果有所差异，水煎液对金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌 （非O1群）、溶藻弧菌、蜡状芽孢杆菌等均有活性［17］。在谭满良等的综述中，综述了10种桉叶提取物的抑菌作用，涉及豆刺盘孢、番茄萎蔫病菌、稻长蠕孢、菜豆壳球孢、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等20种菌［20］。

本研究连续12个月收集了云南临沧地区的赤桉Eucalyptus camaldulensis Dehnh、蓝桉E.globulus Labill和大叶桉E.robusta Smith成熟叶片，采用二氯甲烷及无水乙醇提取其低极性和高极性成分，并采用凝胶平板扩散法测试了不同月份提取物的抑菌活性。希望通过观察一年中其成分和抑菌作用的变化，推测其有效组分。本实验采用气质联用 （GC/ MS）技术分析了低极性提取物中的一些常见挥发性成分，并测试了其二氯甲烷和无水乙醇粗提物对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌等4种常见菌的抑菌作用，为后续谱-效关系及有效成分分析奠定了基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 样品 赤桉Eucalyptus camaldulensis、蓝桉Eucalyptus globulus和大叶桉Eucalyptus robusta三种树叶均为约10年树龄的桉树成熟叶片，采自云南省临沧市永德县勐底农场十队林场，由林场专家杨安川负责采集和鉴别。每月月底采集1次共12次，于通风处阴干备用。

1.1.2 试剂 蓝桉精油（0.89 g/mL，吉安市福达天然药用油厂）；1，8-桉叶油素 （99.5%，0.90 g/mL，武汉远成共创科技有限公司）；β-蒎烯（96.4%，0.85 g/mL，武汉远成共创科技有限公司）；盐酸万古霉素 （注射用，浙江医药股份有限公司新昌制药厂）；亚胺培南西司他丁钠 （注射用，深圳市海滨制药有限公司）；蛋白胨 （OXOID）、牛肉膏和琼脂末 （北京索莱宝科技有限公司）；革兰氏阴性菌大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli，GIM编号ATCC8739）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，GIM编号ATCC9027），以及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，GIM编号ATCC65387）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，GIM编号ATCC12228）（真空冷冻干燥菌种，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心）。

1.2 仪器 旋转蒸发仪（BUCHI R-215，瑞士BUCHI公司）；超声清洗仪 （DS-851007，中国上海生析超声仪器有限公司）；手提式高速粉碎机（DFT-50，浙江温岭市林大机械有限公司）；电子天平 （JA2003N，上海精科天美天平仪器厂）；气相色谱-质谱联用仪（7890A-GC/5975C-MS，HP-5MS 5%Phenyl Methyl Siloxane30 m×0.25μm× 0.25 mm，美国安捷伦公司）及NIST2008谱库（美国国家科学技术研究所）；模拟气候箱 （法国法莱宝公司Froilabo MEDITEST H600）。

2 方法与结果

2.1 桉叶粗提物的制备 将干燥的桉叶粉碎后依次用二氯甲烷和无水乙醇超声提取，分别将两种溶剂的提取液旋蒸至干，称定质量并计算得率。3种桉叶中，蓝桉的二氯甲烷提取物得率最高，平均为13.5%，无水乙醇提取物得率最低，为6.17%；大叶桉的无水乙醇提取物得率最高，平均为14.25%，而二氯甲烷提取物得率最低，为7.17%。三者的平均总得率相近，为19.67% ～21.42%。说明蓝桉的低极性物质即挥发油含有量较高，而赤桉和大叶桉的高极性物质含有量较高。

2.2 桉叶二氯甲烷粗提物的GC/MS分析

2.2.1 供试液配制 二氯甲烷粗提物用丙酮配制成1 mg/mL溶液，内标物采用二氯吩噻嗪，用丙酮配置成0.1 mg/mL溶液，进样前将样品溶液700μL和内标溶液300μL混匀，0.22μm滤膜过滤备用。

2.2.2 气相色谱/质谱（GC/MS）分析 载气为氮气，辅助气为氦气，体积流量1 mL/min；不分流进样；进样口温度 250℃；接口温度 310℃；程序升温；总分析时间为195 min。

2.2.3 相对峰面积、相对保留时间与含有量变化分析 各成分的含有量变化根据相对峰面积变化作半定量分析。相对峰面积的计算方法为：各成分峰面积/内标峰面积。相对保留时间的计算方法为：各峰校正保留时间/内标峰校正保留时间。

2.2.4 方法学验证 取1月份采摘的蓝桉叶及其二氯甲烷提取物进行方法学验证。

2.2.4.1 仪器精密度考察 将蓝桉二氯甲烷提取物制备成样品供试液进行GC/MS分析。连续进样5次，选取1，8桉叶油素、蒎烯、香橙烯、蓝桉醇、松香芹醇峰，分别计算各峰相对保留时间RSD值（相对标准偏差，Relative standard deviation）和各峰相对峰面积RSD值。测定结果表明各峰相对保留时间RSD均＜1%，各峰相对峰面积的RSD均＜1%，仪器精密度良好。

2.2.4.2 方法重复性考察 取同一份蓝桉叶粉末，按二氯甲烷提取物制备方法平行制备5份样品供试液进行GC/MS分析，选上述峰，分别计算各峰相对保留时间RSD值和各峰相对峰面积RSD值。测定结果表明各峰相对保留时间RSD均＜1%，各峰相对峰面积的RSD均＜1%，方法重复性良好。

2.2.4.3 样品稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液，室温条件下放置，按照样品测定方法于0、2、4、8、12 h后进样，选上述峰，计算相对保留时间RSD值和各峰相对峰面积RSD值。测定结果表明各峰相对保留时间RSD均＜1%，各峰相对峰面积的RSD均＜1%，样品稳定性良好。

2.3 3种桉叶的常见挥发性成分在12个月中的含有量变化 不同月份桉叶中所含物质种类以及含有量均有变化。1，8-桉叶油素在蓝桉中含有量最高，赤桉中最低。其他几种挥发性成分，如蒎烯、香橙烯及蓝桉醇等的含有量也是在蓝桉中相对较高，在赤桉中最低，且成分也更加复杂。图1为3种桉叶中几种主要挥发性成分的含有量变化趋势图。

图1 3种桉叶常见挥发性成分及其年度变化Fig.1 Annual changes of common volatile constituents in 3 species of eucalyptus leaves extracts

2.4 蓝桉精油的GC/MS分析 蓝桉精油中主要成分为1，8-桉叶油素。从归一化峰面积分析，含有量超过85%，其他成分为莰烯、蒎烯、水芹烯和松油醇等共计15种。

2.5 抑菌试验

2.5.1 供试液及对照品的配制 二氯甲烷提取物、桉叶精油、1，8-桉叶油素及β-蒎烯均以二甲基亚砜（DMSO）配制成400 mg/mL溶液；无水乙醇提取物用6%DMSO配制成500 mg/mL供试液，再采用连续二倍稀释法，配制成质量浓度分别为1/2，1/ 4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，1/ 512，1/1 024 g/mL的共10个质量浓度的供试药液。亚胺培南西司他丁钠和万古霉素分别以无菌去离子水配制成质量浓度为0.5 mg/mL的药液。

2.5.2 抑菌活性测定 培养基配制方法参照文献［21］，抑菌活性测定采用琼脂平板扩散法［22］。菌株活化并稀释后，将菌悬液均匀涂布到培养基平板上，于37℃培养箱中培养1 h后，在培养基上打直径6 mm孔，向每孔中加入100μL供试药液。二氯甲烷提取物的空白对照组为分析纯DMSO；无水乙醇提取物的空白对照为6%DMSO溶液，设亚胺培南西司他丁钠 （革兰氏阴性菌抗菌药物）对照组和万古霉素 （革兰氏阳性菌抗菌药物）对照组；桉叶成分对照组为蓝桉精油、1，8-桉叶油素和β-蒎烯，各组设3个重复试验，于37℃培养箱中培养18 h，游标卡尺测量加药孔边缘至抑菌圈边缘的距离，即抑菌圈宽度。

2.5.2.1 二氯甲烷提取物的抑菌活性 3种桉叶的二氯甲烷提取物对铜绿假单胞菌的抑制作用均不佳，约2/3的样品对铜绿假单胞菌的抑菌圈环宽度为0。除大叶桉6月份样品对大肠杆菌抑制作用较佳，抑菌环宽度接近6 mm外，其他样品对革兰氏阴性菌的作用均远远低于对革兰氏阳性菌的抑制。总的说来，各种桉叶的二氯甲烷提取物对各种菌的作用基本相当。其中，以大叶桉的二氯甲烷粗提物对表皮葡萄球菌的作用为最佳。3种对照品中，蓝桉精油对4种菌均有较好的抑制作用。在400 mg/mL质量浓度下，对大肠杆菌的抑菌圈宽度为6.5 mm，铜绿假单胞菌5.52 mm，金黄葡萄球菌10.24 mm，表皮葡萄球菌的抑菌圈宽度 ＞20 mm。GC/MS分析表明，蓝桉精油其主要成分为1，8桉叶油素，其归一化峰面积占85%以上，其他成分有松油醇、水芹烯、莰烯、蒎烯及蒎烯的双键异构体等。抑菌试验表明，1，8-桉叶油素对革兰氏阴性菌没有作用，同样，另一种较为常见的成分β-蒎烯除对表皮葡萄球菌有一定作用外，对革兰氏阴性菌无作用，对金黄色葡萄球菌几乎没有作用。图2为3种桉叶对4种菌的抑制作用随采摘月份的变化。

图2 3种桉叶二氯甲烷提取物的抑菌活性及其年度变化Fig.2 Annual changes of bacteriostatic activities of dichloromethane extracts from 3 species of eucalyptus leaves

2.5.2.2 无水乙醇粗提物抑菌作用观察 从抑菌圈数据观察，3种桉叶的无水乙醇粗提物活性相当，对4种常见菌的作用强于二氯甲烷提取物，对G+和G-均有较好的活性，对铜绿假单胞菌的抑菌活性最低，当稀释至7.81 mg/ML时基本上不再有抑制作用；对表皮葡萄球菌仍有明显活性，当稀释到0.98 mg/mL时，依然能观察到明显的抑制作用。稀释至31.25 mg/ML时，其抑菌作用与二氯甲烷提取物在400 mg/mL的质量浓度下相当。不同种桉叶以及同种桉叶的不同月份样品抑菌作用有一定差异。3种桉叶的醇提物均对表皮葡萄球菌作用最好，对铜绿假单胞菌作用最差。图3为31.25 mg/mL质量浓度下各桉叶无水乙醇提取物对4种常见菌的抑菌圈数据随采摘月份的变化。

图3 桉叶乙醇提取物对4种细菌的抑制作用及其年度变化Fig.3 Annual changes of bacteriostatic activities of ethanol extracts from 3 species of eucalyptus leaves

2.5.2.3 对照品抑菌作用 蓝桉精油的抑菌活性远好于二氯甲烷提取物，其对金黄葡萄球菌抑菌圈宽度为10.24 mm，对表皮葡萄球菌的抑菌圈宽度大于20 mm，对革兰氏阴性菌活性较差，对大肠杆菌抑菌圈宽度为6.5 mm，对铜绿假单胞菌抑菌圈宽度为5.52 mm。但其主要成分1，8-桉叶油素抑菌活性很弱，对革兰氏阴性菌无效，对革兰氏阳性菌的活性也很差，对金黄葡萄球菌活性仅为2.27 mm，对表皮葡萄球菌抑菌圈宽度为2.18 mm，β-蒎烯对革兰氏阴性菌无效，对金黄葡萄球菌抑菌圈宽度仅为0.79 mm，对表皮葡萄球菌活性稍好，抑菌圈宽度为6.24 mm。

3 讨论

本实验对12个月连续采摘的3种桉叶提取物抑菌活性进行了分析，并对二氯甲烷提取物中几种常见的挥发油成分变化进行了初步分析。根据GC/ MS图谱，蓝桉二氯甲烷提取物中1，8-桉叶油素含有量在12个月中虽有波动，但均远高于其他各成分含有量。而大叶桉除在9月份样品中稍高外，其他月份中含有量均不高。有报道认为，具有抗菌活性的主要成分为1，8-桉叶油素、斯巴醇、反式松香芹醇、α-蒎烯、对伞花烃、蓝桉醇、隐品酮、β-水芹烯、白千层醇、龙脑莰醇、柠檬烯和异匙叶桉油醇等。采用提取自桉树不同部位的精油进行色质联用分析和抗革兰氏阳性菌和阴性菌的活性试验，可观察到一些主要成分含有量与抗菌活性有相关性，其含氧单萜 （尤其是1，8-桉叶油素）含有量与抗菌活性有较高相关性［6］。分析结果显示，同一月份不同种桉叶提取物以及同一种桉叶不同月份样品提取物的抑菌活性均有差异，GC/MS分析中也观察到其成分亦有较大的差异。虽然1，8-桉叶油素的含有量在不同月份中不同，但在大多数样品中都是含有量最高或较高的成分。本实验中，蓝桉精油对4种常见菌的抑菌活性很好，但其含有量超过85%的主要成分1，8-桉叶油素活性很差。而且我们还观察到，3种桉叶中，1，8-桉叶油素含有量最高的蓝桉二氯甲烷提取物，其抑菌活性并不强于甚至低于含有量较低的大叶桉或赤桉的二氯甲烷提取物。有人认为，1，8-桉叶油素是通过促进其他萜类活性成分穿透细胞膜而达到灭菌的效果［23］。

植物次生代谢产物随环境和气候的变化而变化，不同时间采收的叶片提取物，其活性也会表现出不同。生物活性测试结果表明，桉叶提取物具有杀灭钉螺、抑菌以及抗包虫原头蚴等活性。对不同月份样品或不同树种样品的成分与不同生物活性的进行关联性分析和构-效关系分析，将有助于推测该类植物中针对不同活性的活性成分。虽然本实验采摘的叶片样本均出自于同一林场，但各项数值变化的规律性似乎并不强。因此，我们考虑进一步缩小采集范围，以期获得更具规律性的样本用于灭螺、抑菌以及抗寄生虫作用的谱-效关系及化合物构-效关系的分析。后续试验尚在进行中。

此外，在本实验中，样品扩散能力也可能影响抑菌圈的大小。乙醇提取物的扩散效果好于二氯甲烷提取物，这也可能在一定程度增加了两种不同溶剂提取物的抑菌圈数据差异。

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Annual changes of antibacterial activities and major volatile constituents in leaf extracts froMeucalyptus

TAO Yi1， YIN Meng2， ZHANG Hao-Bing1*
（1.National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Diseases Control and Prevention；WHO Collaborating Centre for Malaria，Schistosomiasis and Filariasis；Key Laboratory of Parasite and Vector Biology，National Health and Family Planning Commision of The People's Republic of China，Shanghai 200025，China；2.ShanghaiMedical School，Shanghai201318，China）

AIMTo analyze the content changes of volatile components in the leaf extracts froMthe 10-yearold eucalyptus（Eucalyptus camaldulensis Dehnh，E.globulus Labill，and E.robusta Smith）picked froMYongde County，Lincang City，Yunnan Province，and to explore their antibacterial activities.METHODSFor twelve consecutivemonths，three kinds ofmature leaveswere collected and dried in the shade and ultrasonically extracted with dichloromethane and absolute ethanol，respectively.The analyses of two extracts were performed on GC/MS，their antibacterial activitiesweremeasured by the agar disc diffusionmethod.RESULTSOf the volatile components contents，E.globulus was themost，and E.Camaldulensis was the least.The antibacterial activity of absolute ethanol extract of the eucalyptuswas stronger than thatof dichloromethane extract.The bacteriostatic activity of both dichloromethane and ethanol extracts against gram-positive bacteria were better than these extracts against gram-negative bacteria.But1，8-eucalyptol，one of themain components，presented poor bacteriostatic activity against both G-and G+bacteria.CONCLUSIONThere are the differences in bacteriostatic activities of three species of eucalyptus leaf extracts in the samemonths，and the same leaves in variousmonths.The activity has little connection with 1，8-eucalyptol.The further study is needed.

Eucalyptus camaldulensis Dehnh；Eucalyptus globules Labill；Eucalyptus robusta Smith；grampositive bacteria；gram-negative bacteria；bacteriostatic activity

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1050-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.027

2014-11-20

国家国际科技合作专项 （2010DFA33970）；国家国际科技合作专项 （2014DFA31130）

陶 奕（1967—），女，从事仪器分析及药物质量研究。Tel：（021）64377008-2606，E-mail：taoyi20032003@163.coM*通信作者：张皓冰 E-mail：zhang-haobing@163.com