一测多评法测定健脾丸中4种黄酮类成分

刘 圆， 魏惠珍， 龚建平， 俞冰荟， 金浩鑫， 杨世林， 饶 毅*

（1.江西中医药大学，江西 南昌330006；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌330006）

一测多评法测定健脾丸中4种黄酮类成分

刘 圆1， 魏惠珍1， 龚建平1， 俞冰荟1， 金浩鑫2， 杨世林1， 饶 毅1*

（1.江西中医药大学，江西 南昌330006；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌330006）

目的建立以橙皮苷为内标的一测多评法，测定健脾丸 （党参、白术、陈皮、枳实、山楂、麦芽）中4种黄酮类成分 （芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）。方法来自10个企业的健脾丸 （浓缩丸和大蜜丸）以甲醇乙酸提取，HPLC分析采用依利特C18柱 （4.6mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇-5.7%醋酸水 （31∶69）；体积流量为1.0 mL/min，检测波长283 nm。结果4种黄酮类成分在各自进样量范围内呈良好的线性关系，在岛津LC 10-AT、Waters 2695-2996和Angilent1260液相色谱系统的相对校正因子重现性良好（RSD＜5%）。以橙皮苷为内标的测定结果与外标法测定结果相对误差＜3%。结论以橙皮苷为内标建立的一测多评法可用于健脾丸中4种成分的定量分析和对其进行质量评价。

一测多评；健脾丸；相对校正因子；芸香柚皮苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷

The QAMSmethod established on hesperidin can evaluate the quality of Jianpi Pills.KEY WORDS：quantitative analysis ofmulti-components by singlemarker（QAMS）；Jianpi Pills；relative correction factor（RCF）；narirutin；naringin；hesperidin；neohespridin

健脾丸源于古代经典名方，由党参、炒白术、陈皮、枳实 （炒）、炒山楂、炒麦芽六味中药组成的复方制剂，是常用的消食导滞方剂［1］。《中国药典》2010年版一部中健脾丸含量测定项下以橙皮苷为检测指标［2］，难以体现中医的整体作用特点。橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷及芸香柚皮苷来源于枳实及陈皮［3-6］，本研究选择健脾丸制剂中上述4种黄酮类成分作为定量测定指标［7-8］，旨在研究一测多评法在多成分定量测定中的可行性。由于橙皮苷对照品廉价易得、稳定，故本研究以橙皮苷为内参物，建立一测多评法［9-12］测定健脾丸中黄酮类成分的分析方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-10AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB104-N万分之一天平（梅特勒-托利多公司）；AUW2200十万分之一天平 （日本岛津公司）；KQ3200超声波清洗仪 （昆山市超声仪器有限公司）；Mili-Q超纯水仪（美国Milipore公司）。

1.2 对照品 对照品柚皮苷 （110722-201111，纯度 93.2%）、橙 皮 苷 （110721-201115，纯 度95.3%）、 新 橙 皮 苷 （111857-201102， 纯 度99.6%）均购自中国食品药品检定研究院，对照品芸香柚皮苷 （130817，纯度99.5%）购自南昌品正贸易有限公司。

1.3 试药 样品信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Sample information

1.4 试剂 甲醇 （色谱纯，上海振兴化工一厂）；36%乙酸（分析纯，汕头市西陇化工厂）；Milipore超纯水。

2 方法与结果

2.1 方法原理 在一定的线性范围内，成分的量（质量或浓度）与检测器响应成正比。即：W=f× A［13-14］。在多指标质量评价时，以药材 （或制剂）中某一典型成分为内参物 （s），建立内参物与其他待测成分间的相对校正因子 （RCF，fs/i）［14］，计算公式为：待测成分浓度计算公

式中Ai为供试品中待测成分i的峰面积，Ci为供试品中待测成分i的浓度，As为供试品中内参物s的峰面积，Cs为供试品中内参物s的浓度。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芸香柚皮苷对照品9.79 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密称取柚皮苷对照品8.90 mg、新橙皮苷对照品9.59 mg分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密称取橙皮苷对照品4.95 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。分别精密量取1 mL芸香柚皮苷、1 mL柚皮苷、1 mL橙皮苷、1 mL新橙皮苷对照品贮备液置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取健脾丸浓缩丸或取重量差异检查项下的大蜜丸，切碎，混匀，取约0.5 g，精密称定，加硅藻土0.5 g，研匀，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相50 mL，密塞，称定质量，超声处理 （功率220W，频率50 kHz）5min，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 依利特色谱柱 （4.6 mm×250 mm，填料为Hypersil ODS 5μm，柱号E2313293，批号11187）；流动相为甲醇 （A）-5.7%醋酸水（B）（31∶69），体积流量1.0 ML/min，进样体积10μL，检测波长283 nm，柱温为室温。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性及专属性试验 精密量取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μL，在上述色谱条件下进样分析。结果显示，供试品溶液色谱中呈现与对照品保留时间相同的色谱峰；芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子在0.97～1.10间，理论板数以橙皮苷计大于3 000，阴性对照在相应位置处未见色谱峰，方法专属性良好。混合对照品、样品及阴性样品HPLC见图1。

图1 混合对照品 （A）、样品 （B）及缺陈皮、枳实的阴性样品（C）HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of Mixed reference substances（A）、sample（B）and samplewithout Citri Reticulatae PericarpiuMor Aurantil Fructus Immaturus（C）

2.4.2 线性与范围 分别精密吸取系列质量浓度的混合对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积 （A）为纵坐标 （Y），进样量（X，μg）为横坐标绘制标准曲线，并进行线性回归。实验结果表明，各成分在各自进样量范围内呈良好的线性关系。结果见表2。

表2 4种黄酮类成分的线性关系考察结果Tab.2 Results of linear equations of four flavones

2.4.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10μL，连续进样6次，记算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面积的RSD分别为1.0%、0.2%、1.4%、0.4% （n=6）。表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、24 h进样10μL，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面积积分值RSD分别为0.7%、0.3%、0.3%、0.4%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验 取批号为121201的样品，平行制备6份供试品溶液并依法测定。结果芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均含有量分别为1.30、5.48、4.90、7.27 mg/g，RSD值分别为1.3%、1.7%、0.7%、0.8%（n=6）。表明方法重复性良好。

2.4.6 回收率试验 精密称取批号为121201已知各成分含有量的健脾丸6份，每份0.25 g，分别加入一定量的对照品，按照供试品溶液的制备方法制备样品溶液，进行回收率测定。结果表明，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的回收率分别为99.9%、102.5%、99.0%、98.6%，RSD值分别为0.8%、0.8%、1.2%、0.9%。表明该方法的准确度良好，具体见表3。

2.4.7 耐用性考察 分别采用3种不同品牌的色谱柱依利特Hypersil ODS、Welch UltimateRXB-C18、COSMOSIL（均为4.6 mm×250 mm，5μm）以及3台不同品牌高效液相色谱仪岛津LC 10-AT、Waters 2695-2996、Angilent1260进行测定，记录仪器色谱行为的变化。实验结果表明，不同条件下所测定的RSD＜3.0%，分离效果理想。因此，健脾丸中4种黄酮类成分定量测定条件较宽，具有较好的耐用性。

表3 4个黄酮类成分的加样回收率Tab.3 Results of recovery tests for four flavones

2.5 相对校正因子的确定

2.5.1 待测组分相对校正因子的计算 取混合对照品溶液，进样5、10、15、20、30μL测定，以橙皮苷为内标，分别计算芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷的相对校正因子，结果见表4。

表4 4种黄酮类成分相对校正因子 （n=2）Tab.4 Relative correction factors（RCF）of four flavones（n=2）

2.5.2 相对校正因子重现性考察 采用岛津LC 10-AT，分别考察了3种不同品牌的色谱柱依利特（Hypersil ODS），Welch（Ultimate XB-C18），COSMOSIL（5C12-MS-Ⅱ）；采用依利特Hypersil ODS色谱柱，分别考察了岛津LC 10-AT、Waters 2695-2996和Angilent1260液相色谱系统对校正因子的影响，结果各成分的相对校正因子重现性良好（RSD＜5%）。结果见表5。

表5 相对校正因子重现性考察 （n=2）Tab.5 Reproducibility of relative correction factors（n=2）

2.5.3 相对校正因子的确定 根据 《一测多评法建立的技术指南》［14］，综合影响校正因子的上述因素，取各次试验获得的相对校正因子的平均值，最终确定芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷的相对校正因子分别为1.16、1.01、0.98。

2.6 待测色谱峰的定位 通过计算在不同色谱仪器或不同色谱柱中各待测成分色谱峰与橙皮苷色谱峰的相对保留时间，对各待测成分进行定位。结果表明相对保留时间的波动较小，其RSD均小于5%，结果见表6。

表6 各成分的相对保留时间 （n=2）Tab.6 Relative reten tion of each coMponent（n=2）

2.7 一测多评法与外标法测定结果比较 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，依法测定10批样品，采用外标法和一测多评法计算健脾丸中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的量，测定结果见表7。

常规的外标法实测值与一测多评法计算的含有量值相对误差＜3%，表明两种方法测得结果没有显著性差异。由此说明一测多评法在健脾丸的多指标成分质量评价中应用是可行的。

3 讨论

3.1 内参物的选择 橙皮苷对照品价廉易得、稳定，具有药理活性［15］，故本实验选用橙皮苷作为内参物来实现制剂中4种成分的同时测定。

表7 一测多评与外标法测定结果比较Tab.7 Contents of flavones by QAMSand ESM

3.2 色谱峰的定位 在只使用单个对照品时，本实验分别采用了各待测成分间的分离度、相对保留时间和时间差3种参数作为其余3个目标色谱峰的定位标准。通过3种不同品牌的高效液相色谱仪和3根不同品牌的色谱柱考察，结果显示相对保留时间重现性更好 （RSD＜5%），更能准确定位目标色谱峰。

3.3 检测波长的选择 芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷是枳实中主要的黄酮类化合物。本实验分别对这4种黄酮类对照品进行紫外光谱扫描，最大吸收光谱均在283 nm左右，该波长下样品各成分峰形较好，基线稳定，故选用283 nm作为检测波长。

3.4 可行性 本实验初步建立了一测多评法用于健脾丸中4种黄酮类成分的定量测定，与外标法测定值无显著性差异 （RSD＜3%），说明建立的校正因子具有较高的可信度，在仅用1个对照品时可实现多指标成分定量测定。

［1］卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂第七册［M］.北京：人民卫生出版社，1993：147.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：1008.

［3］马雪琴，李 辰，袁林华，等.枳实总黄酮提取物中柚皮苷和新橙皮苷的大鼠药代动力学［J］.中国药科大学学报，2013，44（2）.161-166.

［4］吕青林，冯 峰.枳实与青皮主要化学成分对比研究［J］.北方药学，2013（5）：8-9.

［5］郑国栋，蒋 林，杨得坡，等.HPLC法同时测定不同产地广陈皮中5种活性黄酮成分［J］.中草药，2010，41（4）：652-655.

［6］杨秀梅，王 瑾，黄勤挽，等.“一测多评”法测定陈皮中3种黄酮类成分［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（11）：45-49.

［7］陈燕军，余 琦，饶 毅，等.内标多控法测定枳实中黄酮类成分及其不确定度评定研究［J］.药物评价研究，2013，36（1）：39-44.

［8］师永清，康淑荷，王爱军.HPLC法同时测定导赤丸中栀子苷、芍药苷、黄芩苷和盐酸小檗碱［J］.中成药，2013，35（7）：1462-1465.

［9］刘志辉，顾 玮，常星洁，等.“一测多评”法测定麦贞花颗粒中不同类型成分的含有量［J］.中成药，2012，34（12）：2342-2347.

［10］张 倩，张加余，董鲁艳，等.一测多评法测定清开灵注射液中的绿原酸类成分［J］.中成药，2014，36（4）：768-772.

［11］吉丽娜，冯伟红，王智民，等.“一测多评”法与外标法测定三黄片中4种黄芩黄酮类成分［J］.中成药，2012，34（11）：21828-2133.

［12］孔晶晶，朱晶晶，王智民，等.一测多评技术在中成药香连制剂质量评价中的应用［J］.中国中药杂志，2011，36（11）：1445-1448.

［13］李 聪.紫外检测器定量校正因子的性质与实用性探讨［J］.色谱，1990（4）：254-256.

［14］王智民，钱忠直，张启伟，等.一测多评法建立的技术指南［J］.中国中药杂志，2011，36（6）：656-658.

［15］钱俊臻，王伯初.橙皮苷的药理作用研究进展［J］.天然产物研究与开发，2010，22（1）：176-180.

Quantitative analysis of four flavonoids in Jianpi Pills by QAMS

LIU Yuan1， WEIHui-zhen1， GONG Jian-ping， YU Bing-hui1， JIN Hao-xin2， YANG Shi-lin1，RAO Yi1*
（1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China；2.The National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation in Chinese Herbal Medicine，Nanchang 330006，China）

AIMTo determine the four flavones（narirutin，naringin，hesperidin and neohespridin）in Jianpi Pills（Codonopsis Radix，fried Atractylodismacrocephalae Rhizoma，Citri Reticulatae Pericarpium，fried Aurantii Fructus Immaturus，fried Crataegi Fructus，fried Hordei Fructus Germinatus）using quantitative analysis ofmulticomponents by single marker（hesperidin）（QAMS）.METHODSThe separation ofmethanol-acetate acid extract of Jianpi Pills，purchased froMten manufacturers，was performed on Elite C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），using amixture ofmethanol-5.7%acetic acid（31∶69）asmobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min，and detection wavelength was setat283 nm.RESULTSThere was a good relationship between four flavones and relative correction factors repeated on Shimadzu LC 10-AT，Waters2695-2996，and Angilent1260 HPLC systems. The relative error ofmeasured values in internal and external standard method was less than 3%.CONCLUSION

R927.2

：A

：1001-1528（2015）05-0995-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.015

2014-06-24

十二五国家科技支撑计划 （2011BAI04B06）；2015年版国家药典委员会课题 中药提取物新技术在中药质量控制中的应用（2014年）

刘 圆（1988—），女，硕士生，研究方向为中药质量控制。E-mail：lyuan9181@126.com

*通信作者：饶 毅（1964—），男，教授，研究方向为中药质量控制。Tel：13807041192，E-mail：raoyi99@126.com