肺结核丸质量标准研究

王亚娟，谢光磊（.陕西华西制药股份有限公司，宝鸡 703；.东盛科技股份有限公司西安制药厂，西安 70065）

肺结核丸质量标准研究

王亚娟1，谢光磊2（1.陕西华西制药股份有限公司，宝鸡 721013；2.东盛科技股份有限公司西安制药厂，西安 710065）

目的 建立肺结核丸的质量标准。方法 采用TLC法对制剂中制何首乌、白及进行定性鉴别；采用HPLC法对制何首乌中的2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷进行定量测定。结果 薄层色谱鉴别何首乌、白及的斑点清晰，分离效果好，阴性对照无干扰；2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷在6.0～48.0μg·mL－1范围内线性关系良好（r＝0.999 3）。平均回收率为99.0%，RSD为0.30%（n＝9）。结论 该方法简单准确，专属性强，重复性好，可有效控制该制剂的质量。

肺结核丸；质量标准；2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷；TLC；HPLC

肺结核丸由制何首乌、白及、土鳖虫3味中药组成，该品种是在《卫生部药品标准》中药成方制剂第9册收载的肺结核丸（标准编号：WS3－B－1799－94）基础上开发的中药［1］；具有敛阴补肺的功效；临床上用于治疗肺空洞、肺出血。肺结核丸原部颁质量标准中［鉴别］项内容只有显微鉴别，专属性较差，且没有薄层色谱鉴别、含量测定项目，难以较好地控制产品质量。为了保证药品质量，通过实验研究增加了以何首乌、白及对照药材为对照的薄层鉴别方法，并采用HPLC法定量测定肺结核丸中何首乌所含2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷［2－5］。研究结果表明，所建立的TLC和HPLC法专属性强，操作简便可行，重复性好，可以保证该产品的安全性、有效性、稳定性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（大连依利特科学仪器有限公司），Echrom2000色谱数据处理工作站，P200Ⅱ型高压恒流泵，UV－200Ⅱ型紫外检测器；BT255 Sartorius电子天平（十万分之一，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；UV－2410PC紫外分光光度计（无锡科达仪器厂）；KQ－50B超声波清洗器（250W，20kHz，昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 对照药材、对照品均购自中国药品生物制品检定所，何首乌（批号121454－200401）、白及（批号121262－0301）、2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷（批号110844－200003）；肺结核丸（批号080801，080802，080803）及阴性样品均自制。薄层层析用硅胶G（青岛海洋化工集团）；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；哇哈哈纯净水。

2 薄层鉴别

2.1 何首乌的薄层色谱鉴别 取本品，研细，称取2g，加乙醇35mL，加热回流1h，滤过，滤液浓缩至2mL，作为供试品溶液［2］。另取缺制何首乌的阴性样品2g，按上述方法制成阴性供试品溶液。再取何首乌对照药材0.3g，按上述方法制成何首乌对照药材溶液。分别吸取上述供试品溶液、阴性供试品溶液、对照药材溶液各5μL，点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以苯－乙醇（2∶1）为展开剂，展至约4cm，取出，晾干，再以苯－乙醇（4∶1）为展开剂，展至约7cm，取出，晾干，置于紫外光灯（365nm）下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照样品无干扰。

2.2 白及的薄层色谱鉴别 取本品，研细，称取3g，加甲醇20mL，超声处理（250W，20kHz）20min，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，再加盐酸4mL，加热回流30min，立即冷却，用乙醚振摇提取3次，每次30mL，合并提取液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液［2］。另取缺白及的阴性样品3g，制成阴性供试品溶液。再取白及对照药材2g，按上述方法制成对照药材溶液。分别吸取上述供试品溶液、阴性供试品溶液各10μL、对照药材溶液5μL，点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯（365nm）下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照样品无干扰。

3 2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的含量测定

3.1 色谱条件 Hypersil BDS C18（200mm×4.6mm， 5μm）色谱柱；流动相为乙腈－水（25∶75）；检测波长320nm；体积流量：0.8mL·min－1；柱温：室温；进样量：10μL。2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰的保留时间为5.4min，理论板数按2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰计算均大于2 000，2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷及其他物质峰的分离度均大于1.5，符合要求。

3.2 对照品溶液的制备 取2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含15μg的对照品溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备 取本品水蜜丸，研细，取约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50mL稀乙醇，密塞，称定质量，加热回流30min，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，精密吸取续滤液5mL，置于25mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3.4 阴性对照溶液的制备 按处方量以相同的方法制备不含制何首乌的阴性对照样品，再取该样品按3.3项下方法处理，得阴性对照溶液。

3.5 专属性实验 精密吸取对照品、供试品和阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪进行测定。结果显示：阴性对照色谱在与2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品及供试品色谱图相同保留时间处未显吸收峰，故认为其他成分对测定2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷无干扰。见图1。

图1 HPLC图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照品；1.2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside

3.6 线性范围考察 取2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品3mg，精密称定，置于50mL量瓶中，加稀乙醇定容至刻度，作为对照品溶液（60μg·mL－1）。分别精密吸取该对照品溶液1，2，4，6和8mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10μL，记录峰面积，以进样质量浓度X（μg·mL－1）与峰面积Y回归，得回归方程：Y＝504.88 X＋180.65，r＝0.999 3，结果进样质量浓度在6.0～48.0μg·mL－1范围内，线性关系良好。

3.7 精密度实验 取3.6中质量浓度为12μg·mL－1的对照品溶液各10μL，连续进样5次，结果2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷保留时间的RSD为0.17%，峰面积的RSD为0.83%。

3.8 重复性实验 取批号为080801样品，平行精密量取5份，按3.3项下方法处理测定，结果2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的平均含量为7.725mg·g－1，峰面积的RSD为0.28%，表明该方法重复性较好。

3.9 稳定性实验 取批号为080801的供试品溶液，室温放置，分别在0，2，4，6，8和12h进样测定含量，结果供试品溶液的2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷峰面积在12h内基本无变化，峰面积的平均值为7 889.42，RSD为0.94%。

3.10 加样回收率实验 取已测定含量的供试品（080801，2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷含量为7.725mg·g－1）9份各0.25g，精密称定，按高、中、低质量浓度分别加入2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品1.50，2.00和2.50mg，各平行3份，按3.3项下方法操作，在3.1项下色谱条件进样测定峰面积。结果2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的平均回收率为99.0%，RSD为0.30%。见表1。

表1 2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery of 2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside （n＝6）

3.11 含量测定 取肺结核丸样品3批，按上述方法测定，计算2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷含量。结果见表2。

表2 样品中2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷含量测定结果Tab.2 Results of the content of 2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside in samples

4 讨论

取2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷对照品溶液，以流动相为空白，在UV－2410PC紫外分光光度计上，在200～400nm波长范围内扫描，绘制吸收光谱图，在320nm处有最大吸收，基线平稳，分离效果好。故选择320nm为检测波长。

测定2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷时，依《中国药典》2005年版一部何首乌药材的含量测定方法［2］，选择乙腈－水＝25∶75为流动相，结果表明，峰形良好，基线平稳，分离效果较佳。

提取方法考察：在2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷测定中，分别采用加热回流30min及超声提取30min［6］对样品进行处理，测定含量，研究表明，回流30min提取更完全，故采用回流30min的方法。另外，对不同回流提取时间20，30，40和50 min分别进行了考察，结果表明，加热回流30min已基本提取完全，故选择加热回流30min提取。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准：中药成方制剂：第九册［S］.北京：人民卫生出版社，1994：143.

［2］国家药典委员会.中国药典：2005年版［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2005：67，122－123.

［3］廖海民，胡正海，贺定翔，等.制首乌中二苯乙烯苷含量的HPLC测定［J］.西北药学杂志，2006，21（1）：3－4.

［4］李亚林，张浩.HPLC法测定何首乌中二苯乙烯苷的含量［J］.内蒙古中医药，2007，（12）：24－25.

［5］王春英，张兰桐.何首乌中有效成分二苯乙烯苷的研究进展［J］.河北医科大学学报，2008，29（1）：157－160.

［6］张国跃，罗定强，吴芳，等.HPLC法测定不同产地首乌延寿片中2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷的含量［J］.西北药学杂志，2007，22（5）：245－246.

Study on quality standard for Feijiehe Pills

WANG Yajuan1，XIE Guanglei2（1.Shaanxi Huaxi Pharmaceutical Limited Company，Baoji 721013，China；2.Dongsheng Pharmaceutical Technology Limited Company in Xi′an，Xi′an 710065，China）

Objective To investigate the quality standard for Feijiehe Pills.Methods TLC was used to identify Radix Polygonum multiflorum Preparata and Rhizoma Bletillae，and HPLC was used to quantitatively measure 2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside.Results By TLC identification of Rhizoma Bletillae，Polygonum multiflorum，the spots were clear，and no interference was observed；Four hydroxyl 2，3，5，4′－2－2－styrene ＆western－beta－D－glucoside in the range of 6.0－48.0μg·mL－1（r＝0.999 3）demonstrated good linear relationship.The average recovery was 99.0%，and RSD was 0.30%（n＝9）.Conclusion The method is simple，accurate，and with strong specificity and good reproducibility，which shows the method can effectively control the quality of the preparation.

Feijiehe Pills；quality standard；2，3，5，4′－tetrohyoxystilbene－2－O－β－D－glucoside；TLC；HPLC

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.007

R917

A

1004－2407（2015）01－0023－03

2014－06－28）