显色基质法检测乳酸环丙沙星氯化钠注射液的细菌内毒素

曾云胜 张玲莉 彭 燕

1.湖北省仙桃市第一人民医院药剂科袁湖北仙桃433000曰2.武汉大学人民医院药学部袁湖北武汉430060

显色基质法检测乳酸环丙沙星氯化钠注射液的细菌内毒素

曾云胜1张玲莉2彭 燕2

1.湖北省仙桃市第一人民医院药剂科袁湖北仙桃433000曰2.武汉大学人民医院药学部袁湖北武汉430060

目的比较显色基质法与凝胶法检测乳酸环丙沙星氯化钠注射液的细菌内毒素的效果。方法采用样品稀释法研究显色基质鲎试剂对不同批号乳酸环丙沙星氯化钠注射液的干扰袁并与凝胶法鲎试剂对样品的干扰试验比较。结果显色基质法标准曲线的线性相关系数逸0.98袁乳酸环丙沙星氯化钠注射液在0.5 mg/mL浓度时无干扰作用袁明显高于凝胶法无干扰浓度(0.125 mg/mL)。结论与凝胶法比较袁显色基质法有灵敏尧快速尧能定量尧重复性好的特点袁可用于乳酸环丙沙星氯化钠注射液内毒素含量的测定。

显色基质鲎试剂法；凝胶法；细菌内毒素；干扰试验；乳酸环丙沙星氯化钠注射液

注射用乳酸环丙沙星具有广谱抗菌作用袁是较早应用于临床的喹诺酮类药物袁尤其对需氧革兰阴性杆菌引起的感染有效袁由于其价格低廉袁疗效明确袁因此在临床上被广泛应用。2010年版叶中国药典曳规定乳酸环丙沙星氯化钠注射液热原检测采用家兔法[1]袁国家药典委员会于2012年8月3日已经公布的叶关于注射用乳酸环丙沙星的国家标准草案的公示曳袁其中规定了野细菌内毒素检查冶袁用0.06 EU/mL或更高灵敏度的鲎试剂凝胶法检查(叶中国药典曳2010版二部附录欲E[1])袁每毫克环丙沙星中含内毒素的量应小于0.50 EU。在凝胶法检查基础上袁笔者依显色基质法规定袁通过试验进行乳酸环丙沙星氯化钠注射液中显色基质法检查的方法学研究袁以期为环丙沙星检测内毒素寻求较为合适的方法。

细菌内毒素检查法是检测供试品中细菌内毒素的限量的方法袁主要方法分为凝胶法和光度测定法袁后者包含浊度法和显色基质法。法定标准规定越来越多的注射制剂采用此法控制药品中热原的含量。近年来袁药典委员会要求各地药检部门做了很多工作袁研究细菌内毒素检测方法的合理性和可靠性。笔者对乳酸环丙沙星氯化钠注射液的细菌内毒素检测进行方法学研究袁建立了显色基质法检测该药中细菌内毒素方法袁相比凝胶法袁更快速准确。

1 仪器与试剂

1.1 显色基质鲎试剂盒

显色基质鲎试剂(批号院120603)1.7 m L袁显色基质(批号院120605)1.7mL袁偶氮化试剂一(批号院120628) 10 mL袁偶氮化试剂二(批号院120629)10 mL袁偶氮化试剂三(批号院120630)10mL袁HCl反应终止剂(批号院120623)50 mL。由厦门市鲎试剂试验厂有限公司生产。

1.2 凝胶法鲎试剂

鲎试剂(灵敏度0.25 EU/mL袁厦门市鲎试剂试验厂有限公司袁批号院130917)曰鲎试剂(灵敏度0.03EU/mL袁厦门市鲎试剂试验厂有限公司袁批号院030511)曰鲎试剂(灵敏度0.03 EU/mL袁湛江安度斯生物有限公司袁批号院1301161)。

1.3 其他试剂

细菌内毒素标准品(CSE)(100 EU/支袁中国药品生物制品检定所袁批号院150608-201298)曰细菌内毒素检测用水(BET水)(厦门市鲎试剂试验厂有限公司袁批号院130428)50 mL。

1.4 样品

乳酸环丙沙星氯化钠注射液(商品名院西普乐袁拜耳制药有限公司袁100 mL颐0.2 g颐0.9 g)3批(批号院BXGG4D7尧BXGG4F1尧BXGG4C6)。

1.5 其他材料

紫外可见分光光度计UV-2450(日本岛津仪器公司)袁除热原吸头(200尧1000滋L)袁玻璃比色杯(0.5 cm)袁涡旋混合仪Vortex-Genie 2(美国Scientific Indus鄄tries)袁电热恒温水浴锅TZL-5003(苏州珀西瓦尔试验设备有限公司)袁定量可调移液器(上海求精玻璃仪器厂袁100耀1000滋L袁20耀200滋L)盛冰水托盘袁试管架。

2 方法与结果

2.1 确定供试品内毒素限值

细菌内毒素限值L=K/M袁其中K表示人每千克体质量每小时最大可接受的细菌内毒素剂量袁药典规定一般注射剂为5 EU/(kg窑h)袁M表示人每千克体质量每小时的最大供试品剂量[1]。乳酸环丙沙星氯化钠注射液说明书规定成人1 h静注最大剂量600mg袁人均体质量按60 kg估算袁则M=10 mg/(kg窑h)。计算得出本品的细菌内毒素限值L=0.5 EU/mg袁环丙沙星氯化钠注射液的浓度为2mg/mL袁限值即为L=1 EU/mL。

2.2 可靠性试验

显色基质法标准曲线的绘制院取细菌内毒素标准品(CSE)1支袁加入1 m L BET水复溶袁旋涡震荡混合15 min袁即得100 EU/mL细菌内毒素溶液袁然后取0.1mL细菌内毒素溶液袁加入BET水0.9mL袁涡旋震荡30 s袁稀释为10 EU/mL袁再继续用BET水将其稀释至1 EU/mL细菌内毒素母液袁备用。取相应量鲎试剂尧显色基质尧偶氮化试剂二尧偶氮化试剂三分别用BET水溶解袁偶氮化试剂一用HCl反应终止剂溶解袁震荡10 s袁备用。取2mL空安瓿15支袁分别加入细菌内毒素检查用水(1.0尧0.8尧0.6尧0.4尧0.2mL)和1 EU/mL的细菌内毒素母液(0尧0.2尧0.4尧0.6尧0.8 mL)制成系列细菌内毒素标准溶液(分别含有细菌内毒素0尧0.2尧0.4尧0.6尧0.8 EU/mL)。取标准溶液0.1 mL分别加入反应试管中(冰浴袁预先加有0.1mL鲎试剂的除热原玻璃试管10 mm伊75 mm)袁震荡10 s后袁置于37益水浴箱中孵育10 min袁取出试管曰加入显色基质0.1 mL(冰浴)袁再置入37益水浴箱孵育6 min袁取出试管曰迅速加入偶氮试剂一(冰浴)尧偶氮试剂二尧偶氮试剂三各0.5 mL。静置5min后袁检测样品反应液在545 nm处的吸光度袁用空白对照管校正。平均吸光度测定值依次为0.03尧0.153尧0.311尧0.456尧0.641。平均吸光度对内毒素浓度作线性回归袁得标准曲线Y=0.7256X+0.1878 (r=0.9972)袁r逸0.98袁试验有效。

2.3 显色基质法的样品干扰试验

将批号为BXGG4D7尧BXGG4F1尧BXGG4C6的乳酸环丙沙星注射液样品袁即浓度为2.0 mg/mL的样品溶液袁成倍稀释4个稀释级(1颐2尧1颐4尧1颐8尧1颐16样品稀释液袁即浓度为1.0尧0.5尧0.25尧0.125mg/mL的样品溶液袁称为NPC溶液)袁分别用4个不同稀释级供试品溶液加入1 EU/mL内毒素标准品溶液袁配制浓度为0.5 EU/mL内毒素样品系列溶液(称为PPC溶液)曰分别测量不同浓度PPC系列和NPC系列样品在545 nm处的吸光度袁然后依据内毒素标准曲线方程计算样品中内毒素浓度。加入内毒素标准溶液的供试品溶液内毒素浓度(Cs)和未加内毒素标准溶液的供试品溶液内毒素浓度(Ct)袁通过公式计算不同稀释倍数溶液的内毒素回收率(R)院R=(Cs原Ct)/0.5伊100%。表1结果显示袁样品稀释至1颐4尧1颐8尧1颐16倍后对鲎试剂显色没有干扰作用袁细菌内毒素回收率都在50%耀100%。样品原液和1颐2倍样品稀释溶液有一定抑制干扰作用袁细菌内毒素显色作用被抑制袁回收率不足50%袁表明样品稀释至0.5 mg/mL可以消除样品对显色鲎试剂的干扰。

2.4 凝胶法的样品干扰试验

2.4.1 干扰试验相关样品浓度的计算凝胶法鲎试剂的灵敏度一般在0.03耀0.50 EU/mL袁在确定乳酸环丙沙星氯化钠注射液的细菌内毒素限值为1 EU/mL后袁可求得样品的最小非干扰质量浓度不能低于原液17倍稀释浓度袁即0.117 mg/mL。

2.4.2 乳酸环丙沙星氯化钠注射液干扰预试验取灵敏度姿为0.25 EU/mL的鲎试剂做预试验袁将供试品(批号院BXGG4D7)分别稀释至1.0尧0.5尧0.25尧0.125尧0.0625 mg/mL后进行干扰试验袁同时配制两份一系列同样浓度的样品溶液袁分别在其中加入内毒素袁使每一浓度的样品溶液中含有2姿(0.5 EU/mL)和0.25姿(0.0625 EU/mL)的细菌内毒素袁此系列溶液被称为供试品阳性对照液袁试验取细菌内毒素标准溶液和细菌内毒素检查用水分别做阳性对照液尧阴性对照液袁每个样品平行操作2管。表2可见乳酸环丙沙星氯化钠注射液(在0.125 mg/mL或更低质量浓度时)不会抑制干扰鲎试剂凝集。

表1 显色基质法的样品细菌内毒素干扰试验结果

表2 凝胶法乳酸环丙沙星氯化钠注射液的干扰预试验结果

2.4.3 供试品的干扰试验分别取厦门鲎试剂试验厂有限公司和湛江安度斯生物有限公司两个不同厂家生产的灵敏度为0.03 EU/mL(批号分别为1301161尧130511)的鲎试剂袁对3批(BXGG4D7尧BXGG4F1尧BXGG4C6)0.125mg/mL的乳酸环丙沙星氯化钠注射液进行细菌内毒素检查的干扰试验袁计算细菌内毒素检查用水和乳酸环丙沙星氯化钠注射液稀释样测定的反应终点浓度几何平均值Es和Et袁当Et在0.5耀2.0时袁认为乳酸环丙沙星氯化钠注射液在该浓度下不干扰鲎试剂试验袁每管平行操作4份袁阴性对照设2个平行管。表3显示袁乳酸环丙沙星氯化钠注射液在稀释至0.125mg/mL时袁其测定Et与细菌内毒素检查用水的Es相比均在0.5耀2.0袁且Es与鲎试剂灵敏度(0.5耀2.0)姿一致袁样品稀释液对细菌内毒素检查无干扰作用。

表3 凝胶法供试品的干扰试验结果

2.5 样品的测定

2.5.1 显色基质法样品测定选择样品(原浓度2.0mg/mL)加入BET水袁制得稀释液1颐4(稀释后浓度0.5mg/mL)作为供试品溶液检查各批样品内毒素含量。取供试品0.1 mL按野2.2冶项操作袁测定供试品内毒素含量袁结果BXGG4D7尧BXGG4F1尧BXGG4C6三批样品定量检测结果表明内毒素含量均小于0.01 EU/mL袁符合规定限度1 EU/mL以下。

2.5.2 凝胶法样品测定取乳酸环丙沙星氯化钠注射液稀释至0.125mg/mL作为供试品溶液袁用灵敏度姿= 0.03 EU/mL凝胶鲎试剂检查袁结果BXGG4D7尧BXGG4F1尧BXGG4C6三批样品结果均呈阴性袁即小于1 EU/mL袁符合规定。

3 讨论

显色基质法相对凝胶法有抗干扰能力增强的优点。文献表明[2]袁凝胶法稀释倍数为16倍袁略低于最大稀释倍数17倍曰在检测时鲎试剂只能选取最小灵敏度(0.03 EU/mL)进行试验袁增加试验耗材成本曰最大不干扰试验浓度0.125 mg/mL袁略大于最小稀释样品浓度0.117 mg/m L袁因此检测时袁稀释过程较多袁容易引入试验误差曰终点显色基质法与凝胶法相比袁不仅抗干扰浓度提高至0.5 mg/m L袁具有较好的抗干扰能力袁减少试验操作多次稀释带来的误差袁而且能定量测定样品中的细菌内毒素含量袁因此该试验方法更准确尧科学。选用显色基质定量鲎试剂方法测定乳酸环丙沙星氯化钠注射液具有优势。

显色基质法相对其他定量方法的优点是试验条件相对低廉袁易于开展。根据2010年版叶中国药典曳附录[1]袁细菌内毒素含量定量方法有多种[3-10]袁与其他细菌内毒素含量测定方法相比袁终点显色基质法的检测方法是在供试品和鲎试剂及显色基质之间的显色反应被HCl终止后袁通过可见分光光度计检测反应溶液在特定波长处吸光度来定量袁试验设备条件要求不高袁并且具有很好的重复性和可操作性。

干扰试验的常用方法和结果袁显色基质法考察的关键因素是样品的干扰试验[11-14]。用供试品溶液配制样品阳性溶液袁只有在样品干扰试验中袁细菌内毒素检测回收率达到要求范围袁试验结果方为有效。排除样品溶液对鲎试剂的干扰方法包含样品稀释法和其他一些适宜的方法袁如色氨酸难溶于水袁需要加热至80益袁再稀释后才能检测内毒素袁而门冬氨酸和谷氨酸不仅需要稀释袁还需要加入NaOH溶液调节pH至7.0后才能消除对试验的干扰[15]。干扰试验证明袁采用0.5mg/mL乳酸环丙沙星氯化钠注射液稀释液作内毒素含量检查溶液袁回收率符合要求。

显色基质法比凝胶法有定量和抗干扰强的优势袁但目前显色基质法并没有得到较好的推广应用袁主要有两个方面因素院淤显色基质鲎试剂试验操作过程略显繁琐[16]袁不仅鲎试剂反应后孵育袁而且增加显色基质加入样品孵育过程袁最后另加入偶氮试剂显色袁比较耗费试验时间曰于定量鲎试剂价格相比凝胶法没有竞争力袁以检测15个样品为例袁凝胶法平均每单个样本需要耗材约为定量显色鲎试剂的一半。相信随着显色基质鲎试剂生产工艺的改进袁其成本会进一步降低袁将被广泛应用。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京院中国医药科技出版社袁2010院304袁附录90-附录102.

[2]陈叶平袁高婷婷.注射用乳酸环丙沙星细菌内毒素检查方法研究[J].临床合理用药杂志袁2011袁4(10)院98-99.

[3]汤秋华袁林辉袁张一帆袁等.动态浊度法测定醒脑静注射液的细菌内毒素含量[J].中国医药指南袁2014袁12(22)院21-23.

[4]吴兵袁于旭博袁刘方蕾.脑膜炎球菌结合疫苗制备过程中各阶段产物的细菌内毒素含量分析[J].中国新药杂志袁2014袁23(11)院1252-1259.

[5]裴宇盛袁蔡彤袁高华.细菌内毒素检查新方法进展[J].药物分析杂志袁2014袁34(3)院392-395.

[6]焉媛媛袁章颖慧袁周晓琳.血凝酶细菌内毒素检查法建立[J].中国药师袁2014袁17(3)院524-525.

[7]贺康洪袁王锦袁张晓吟.丹参酮域A磺酸钠注射液细菌内毒素检查法的可行性研究[J].解放军药学学报袁2014袁30 (4)院342-344.

[8]李逢春.注射用兰索拉唑细菌内毒素检查法的建立[J].中国药房袁2014袁25(25)院2379-2380.

[9]汤艳群袁肖贵南.注射用维生素C中细菌内毒素的定量检测[J].广东药学院学报袁2014袁30(4)院459-562.

[10]周筱莉.我国细菌内毒素检查法的应用进展[J].中国医药导报袁2010袁7(23)院14-16.

[11]黄清泉袁夏振民.药品细菌内毒素检查的试验设计[J].中国药学杂志袁1997袁32(2)院72-74.

[12]周孝文袁李波.细菌内毒素检查法常见问题[J].中国药学杂志袁2006袁41(19)院1516.

[13]裴宇盛袁蔡彤袁张宇辰袁等.中国药典2010年版细菌内毒素检查凝胶法干扰试验判断模式研究[J].药物分析杂志袁2014袁34(7)院1296-1299.

[14]彭燕袁张玲莉袁王宗春.显色基质法定量检测盐酸多沙普仑注射液的细菌内毒素[J].中国药房袁2014袁25(41)院3909-3911.

[15]蔡彤袁张国来袁李波袁等.84种注射用药品细菌内毒素检查法的方法学研究[J].中国药学杂志袁2010袁45(2)院150-155.

[16]王莉袁高华袁蔡彤袁等.鲎试剂的研究及其应用进展[J].药物分析杂志袁2007袁27(6)院938-942.

Bacterial endotoxin test of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection by chromogenic substrate limulus amebocytelysate

ZENG Yunsheng1ZHANG Lingli2PENG Yan2
1.Department of Pharmacy,the First People忆s Hospital of Xiantao City,Hubei Province,Xiantao 433000,China; 2.Department of Pharmacy,People忆s Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

Ob jective To compare bacterial endotoxin test of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection by chromogenic substrate limulus amebocytelysatemethod and sol-gelmethod.M ethods Sample dilutionmethod was used to study of chromogenic substrate limulus reagent on different batches of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection,compared with interfering test of sol-gel limulus reagent sample.Results The standard curve correlation co鄄efficient of chromogenic substrate limulus amebocytelysate was above 0.98.Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection was not interferewith the concentration of 0.5mg/mL,which was obviously higher than that ofgel coltmethod (0.125 mg/mL).Conclusion Compared with sol-gelmethod,chromogenic substratemethod has the characteristic of sen鄄sitive,rapid,quantitative and good repeatability,can be used for content determination on endotoxin of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection.

Chromogenic substrate limulus amebocytelysate method;Sol-gelmethod;Bacterial endotoxin;Interfering test;Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloricle Injection

R965

A[文献标识码]1673-7210（2015）06（c）-0092-04

院2014-02-09本文编辑院李亚聪)

湖北省自然科学基金项目(2013CFB239)。

曾云胜(1968.10-)袁男袁湖北仙桃人曰研究方向院医院药学曰主要成果院仙桃市科技进步一等奖一项。

彭燕(1976.3-)袁女袁湖北人袁硕士曰研究方向院临床药学和医院药学曰主要成果院湖北省科技进步三等奖两项袁湖北省科技进步二等奖一项袁武汉市科技进步三等奖一项袁武汉市科技进步二等奖一项。