胶乳增强免疫比浊法定量测定血浆中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的方法学评价及临床应用

孙丽，牛国平

(徐州市中心医院检验科，江苏徐州221009)

胶乳增强免疫比浊法定量测定血浆中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的方法学评价及临床应用

孙丽，牛国平

(徐州市中心医院检验科，江苏徐州221009)

目的对胶乳增强免疫比浊法(LEIA)定量测定血浆中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)进行方法学评价并探讨其初步的临床应用。方法应用美国临床实验室标准化协会(CLSI)的标准化评价方案评价LEIA测定血浆NGAL的不精密度、回收率、线性范围、抗干扰性、稳定性等指标。同时测定86例2型糖尿病(T2DM)患者(其中包括41例糖尿病肾病(DN)患者)、40名体检健康者(正常对照组)的血浆NGAL水平。结果LEIA测定血浆NGAL低、高水平的批内变异系数(CV)分别为3.76%、1.79%;日间CV分别为6.62%、3.45%。平均回收率为97.3%～104.6%;在0～5 000 μg/L内线性良好，线性范围内偏差＜8%。与进口同类试剂盒(粒子增强免疫比浊法)具有高度相关性(R2=0.996 6)，两种检测方法在200和700 μg/L处的偏倚分别为3.66和11.79 μg/L，均满足厂家规定的要求。总胆红素≤600 μg/L、血红蛋白≤10 g/L、维生素C≤0.6 g/L、甘油三酯≤15 mmol/L时对LEIA测定血浆NGAL均无明显干扰;试剂在仪器2～8℃的条件下放置，至少可保存稳定35 d;20名健康体检者血浆NGAL水平均处于厂家声明的参考区间内。正常对照组、T2DM组和DN组血浆NGAL水平呈逐步增高趋势，各组间差异均有统计学意义(P均＜0.01)。血浆NGAL与血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)、肌酐(Cr)呈正相关(相关系数分别为0.58、0.43，P均＜0.01)。结论LEIA测定血浆NGAL具有较高的灵敏度和精密度，所测结果准确可靠，能直接在自动生化分析仪上使用，操作简便、快速，适用于大批量测定。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白;胶乳增强免疫比浊法;方法学评价

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)，也称为脂质运载蛋白-2(lipocalin-2)，是脂质运载蛋白家族成员之一，于1993年由KJELDSEN等[1]在研究人类中性粒细胞92000明胶酶B[即基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)]时首先发现，存在于培养的活化中性粒细胞上清液中。近年来研究发现，血浆NGAL能迅速、灵敏、特异地反映各种肾脏疾病的损伤及恢复过程，成为检测肾损伤新的生物学指标[2-10]。同时NGAL在心脑血管疾病、糖尿病等领域的研究也逐渐展开，其在临床上具有广阔的应用前景。胶乳增强免疫比浊法(latex-enhanced immunoturbidimetric assay，LEIA)是近年来开展起来的一种高灵敏度、高特异性的免疫检测方法，可直接在全自动生化分析仪上进行批量测定，因此在临床上已得到广泛应用。我们应用美国临床实验室标准化协会(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的标准化评价方案对LEIA测定血浆NGAL进行方法学评价，并探讨该方法的临床应用价值。

材料和方法

一、对象

按1999年世界卫生组织的糖尿病诊断和分型标准[11]，选择2014年1月至2014年7月在徐州市中心医院治疗的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者86例，其中男47名、女39名，年龄41～63岁;选取2014年1月至2014年7月徐州市中心医院体检中心健康体检者40名作为正常对照组，其中男22名、女18名，年龄37～55岁，无肾小球肾炎、糖尿病、良性肾动脉硬化、系统性疾病肾脏损害等。所有研究对象均无严重心功能不全、冠心病、肝病、胶原疾病、脑梗死及肺部疾病。

二、仪器与试剂

日立7600-020型全自动生化分析仪(日本日立公司)。NGAL检测试剂盒1(LEIA，批号: 20130612)、校准品(批号:20130711)、质控物(批号:20130612)均由上海科华生物技术有限公司提供。NGAL检测试剂盒2(粒子增强免疫比浊法，批号:062051)、校准品(批号:062041)、质控物(批号:062041-01)均采用丹麦BioPorto Diagnostics A/S公司提供。两种试剂盒检测原理与分析参数基本相同。

三、检测原理

待测样本中NGAL与试剂中包被于聚苯乙烯粒子上的NAGL抗体结合，形成不溶性免疫复合物，该免疫复合物由于包被的聚苯乙烯粒子而使浊度进一步放大，在NGAL抗体足量的情况下，其浊度与样本中NGAL含量成一定比例关系，与相同条件下操作的标准品比较，通过剂量/反应曲线求出样本中NGAL的含量。

四、主要分析参数

样本体积为3.0 μL，试剂1(R1)为150 μL，试剂2(R2)为50 μL;采用两点终点法:反应方向为向上反应，主波长570 nm，副波长800 nm，反应温度为37℃，第19个读光点读取吸光度值1 (A1)，第34读光点读取吸光度值2(A2)，待测标本A=A2-A1。

五、方法学评价

1.精密度参考CLSI EP5-A2文件，分别测定低值(206 μg/L)和高值(707 μg/L)NGAL。2 h内两水平连续测定20次，计算均值()、标准差(s)、批内变异系数(CV);然后两水平每天测定1次，连续测定20 d，计算、s、日间CV。

2.回收实验参考CLSI EP15-A文件，制备1份新鲜的患者混合血浆作为基线标本，重复测定5次求平均值，向每一份1.8 mL的混合基线标本中分别加入0、50、100、150、200 μL NGAL高值校准品(600 μg/L)，再分别加入200、150、100、50、0 μL生理盐水。将上述5份体积均为2.0 mL的标本用LEIA进行3次重复检测并计算平均值。通过测定值减去各自基线值确定回收量，回收率(%)=回收量/加入量×100。

3.线性实验参考CLSI EP6-A文件，以蒸馏水为1号标本，以高值(5 000 μg/L)校准品为6号标本，将1号标本和6号标本按5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、0∶5的比例进行混合，分别对6个标本重复测定3次，取平均值为测得浓度(Y)，对设定的理论浓度(X)与实际测得浓度采用多次回归方案进行线性评价，并获得其回归方程及相关系数(r)。

4.相关性分析按CLSI EP9-A2文件要求做方法学对比实验。选择64份包括高、中、低浓度的临床样本，每天测定8份样本，分别用粒子增强免疫比浊法(进口试剂)和LEIA按1→8测定，第2次按8→1重复测定，连续测定8 d。将两种检测系统测得的结果进行相关性分析，若显著相关，计算其回归方程及两种检测方法间的偏倚。

5.抗干扰试验参考CLSI EP7-A2文件，收集外观正常且无溶血、黄疸、脂血的新鲜混合血浆标本，分别加入一定量的胆红素(浓度分别为200、300、400、500、600 mg/L)、血红蛋白(浓度分别为2、4、6、8、10、12g/L)、甘油三酯(triglyceride，TG)，浓度分别为1、2.5、5、10、15、20 mmol/L)和维生素C(浓度分别为200、300、400、500、600 mg/L)，干扰物质与混合血浆的体积之比为1∶9，另1份加入等体积的生理盐水作为对照。每份标本重复测定3次，计算各自的平均干扰值，以相对偏差＜10%作为该检测方法对干扰物的判断限[12]。在范围内判断为无明显干扰，否则为有明显干扰。

6.试剂开瓶稳定性将试剂在2～8℃条件下，在仪器上开盖放置40 d，第0天(即当天)校准后不再校准，分别在第0、5、10、15、20、25、30、35、40天测定相同两份(低值、高值)血清样本，重复3次，计算及相对偏差。以相对偏差＜10%作为该试剂稳定性的判断限。

7.参考区间验证选择徐州市中心医院体检中心健康体检者20名(男、女各10名，年龄19～70岁)作为参考个体，无糖尿病、肾小球肾炎、良性肾动脉硬化、系统性疾病肾脏损伤等能引起血浆NGAL水平升高的疾病。采集空腹静脉血3 mL，置于EDTA-Na2抗凝管中离心后分离血浆，测定NGAL水平。测定结果采用Dixon法进行离群值检验。若出现离群值要剔除，用新的参考个体代替，补足20名。观察20名参考个体的检测值在厂家声明的参考区间之外是否超过2例。

8.临床试验将86例T2DM患者根据尿微量白蛋白/尿肌酐比值(albumin to creatinine ratio，ACR)分组。(1)正常白蛋白尿组(NA):45例，男25例、女20例，年龄42～63岁，ACR＜30 mg/mmoL; (2)高白蛋白尿组(含大量和微量白蛋白尿患者，即CN+MA组):41例，男22例、女19例，年龄41～59岁，ACR≥30 mg/mmoL。采用LEIA测定86例T2DM患者及40名体检健康者(正常对照组)血浆NGAL和血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatin C，Cys C)，同时分别采用胆固醇氧化酶法、甘油磷酸氧化酶法、清除法、紫外-谷氨酸脱氢酶法、肌氨酸氧化酶法、氧化酶法、己糖激酶法和速率法检测总胆固醇(total cholesterol，TC)、TG、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C)、尿素(urea)、肌酐(creatinine，Cr)、尿酸(uric acid，UA)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)并做相关性分析。

六、统计学方法

结果

一、精密度评价

LEIA测定NGAL低、高值的批内CV分别为3.76%、1.78%，日间CV分别为6.62%、3.45%，均低于试剂厂家声明的不精密度，见表1。

表1 LEIA的批内与日间精密度

二、回收率

作为基线标本的新鲜混合血浆的平均值为180 μg/L，NGAL高值校准品为600 μg/L，计算平均回收率为99.7%，符合实验要求。见表2。

表2 回收试验结果

三、线性范围

采用多项式回归对结果进行处理，结果显示3种回归处理的一次系数b1差异均具有统计学意义(P＜0.05)，二次回归系数和三次回归多项式的二、三次系数均无统计学意义(P＞0.05)，因此该实验结果是线性的。以理论值为横坐标(X)、实测值为纵坐标(Y)进行直线回归分析。结果显示LEIA测定血浆NGAL在0～5 000 μg/L范围内线性良好，相关方程为Y=1.059X-41.143，R2=0.995 7。见图1。

图1 LEIA测定血浆NGAL的线性实验

四、相关性分析

用粒子增强免疫比浊法(进口试剂)和LEIA平行测定64例样本，以测定结果为X轴、LEIA测定结果为Y轴、进行相关性分析。结果显示两种检测方法呈高度正相关，直线回归方程为Y= 0.969X-9.836，R2=0.996 6，P＜0.01。见图2。利用回归方程中的斜率和截距计算得NGAL在 200和700 μg/L处两种检测方法间的偏移分别为3.66和11.79 μg/L，远低于厂家规定的允许偏倚(7.5%)。

五、抗干扰性

总胆红素≤600 mg/L、TG≤15 mmol/L、血红蛋白≤10 g/L，维生素C≤600 mg/L时对NGAL的测定无明显干扰，符合厂商声明。

六、试剂开瓶稳定性

在第35天测定低值的相对偏差为9.38%，高值的最大偏差为6.01%，均在试剂厂家声明误差范围内，见表3。试剂开瓶后可稳定35 d，稳定性良好。

图2 两种检测方法测定血浆NGAL结果的相关性

表3 试剂开瓶稳定性试验

七、参考区间验证

20名健康体检者的血浆NGAL测定结果在52～319 μg/L之间，为99.4 μg/L，均处于厂家声明的参考区间(＜400 μg/L)内。

八、临床试验

CN+MA组、NA组及正常对照组年龄及男、女比例差异均无统计学意义(P＞0.05)，其他项目测定结果见表4。正常对照组、T2DM组和DN组血浆NGAL水平分别为101.40±7.70、 158.10±13.24和(237.80±30.60)μg/L，呈逐步增高趋势，各组间差异均有统计学意义(P均＜0.01)，见图3。血浆NGAL与血清Cys C、Cr呈正相关(r值分别为0.58、0.43，P均＜0.01)，见图4、图5。

表4 CN+MA组、NA组及正常对照组一般资料比较

图3 各组患者血浆NGAL水平比较

图4 血浆NGAL与血清CysC的相关性分析

图5 血浆NGAL与血清Cr的相关性分析

讨论

NGAL蛋白由一条肽链构成，肽链由C端的α螺旋，N端的310螺旋和中间的8段反平行式β折叠构成的β折叠桶组成，具有典型的β2折叠桶状结构，其相对分子质量为25 000[13]。正常人体中NGAL的表达在不同组织细胞中差异较大。生理状态下成熟的中性粒细胞不能合成NGAL，但炎症因子的刺激可以促进其储存在细胞内特殊颗粒的NGAL蛋白的分泌。研究发现，在肾脏发生缺血的极早期(≤2 h)，NGAL在血、尿中的含量即明显升高。因此，NGAL可作为急性肾脏病变的早期标志物[2-10]。FASSETT等[14]分析88例慢性肾脏病患者时发现，血浆NGAL含量与慢性肾病发病明显相关，可作为疾病诊断指标。所以NGAL不但是急性肾脏疾病早期的标志物，同时与慢性肾脏疾病也明显相关。

目前NGAL的测定方法主要有免疫印迹法、放射免疫法、酶联免疫法及化学发光法。免疫印迹法操作复杂，测定精密度低;放射免疫法存在着环境污染问题;酶联免疫法受人为因素影响较大、自动化程度不高，难以满足临床大批量标本的检测;而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定仪器。这些原因导致NGAL的应用范围较小，难以在临床上普及应用。本研究采用LEIA测定血浆NGAL水平，该方法简便、快速、灵敏、可靠，对仪器设备要求不高，可以在全自动生化仪上应用。方法学性能评价结果表明，LEIA测定血浆NGAL低、高水平的批内CV分别为3.75%、1.79%，日间CV分别为6.63%、3.45%，均符合厂商对不精密度的要求;平均回收率为97.3%～102.6%;在0～5 000 μg/L处线性良好，线性范围内偏差＜8%。与进口同类试剂盒具有高度相关性(R2= 0.996 6)，偏倚均在厂家推荐的范围内;血红蛋白≤10 g/L、总胆红素≤600 mg/L、维生素C≤0.6 g/L、TG≤15 mmol/L无明显干扰;在仪器2～8℃条件下放置至少可用35 d。DN组血浆NGAL水平明显高于T2DM组和正常对照组(P＜0.01)，且与血清Cys C、Cr呈正相关(r值分别为0.58、0.43，P均＜0.01)。因此血浆NGAL水平与肾损伤的严重程度相一致，是出现于DN早期的生物学指标[10，15]，可以作为DN早期无创性的诊断指标。

综上所述，LEIA检测血浆NAGL操作简便、快速，可在十几分钟内即可得出结果，适宜在全自动生化分析仪上批量操作使用，不需要特殊的仪器设备。该方法具有良好的精密度和正确度，相关性好，线性范围宽，抗干扰能力强，具有重要的临床应用价值，适合在临床上广泛开展。

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Evaluation and clinical application of latex-enhanced immunoturbidimetric assay for the detection of plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin

SUN Li，NIU Guoping.(Department of Clinical Laboratory，Xuzhou Central Hospital，Jiangsu Xuzhou 221009，China)

ObjectiveTo evaluate latex-enhanced immunoturbidimetric assay(LEIA)for the detection of plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)and its clinical application.MethodsLEIA was used to determine the concentration of plasma NGAL according to the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)standardization evaluation protocal.The imprecision，recovery rate，linear range，anti-interference and stability were assessed.The plasma NGAL levels of 86 patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM)，including 41 patients with diabetic nephropathy(DN)，and 40 healthy subjects(healthy control group)were determined.ResultsThe within-run coefficients of variation(CV)for low and high levels of NGAL were 3.76%and 1.79%，respectively.The inter-day CV were 6.62%and 3.45%，respectively.The average recovery rate was 97.3%-104.6%.The linear range was from 0 to 5 000μg/L，and the deviation was＜8%.Comparing with similar foreign kit(particle-enhanced immunoturbidimetric assay)，the correlation was high(R2=0.996 6).The system biases of 200 μg/L and 700 μg/L were 3.66 μg/L and 11.79 μg/L，respectively.The results met the requirements of manufacturers.There was no significant interference on the determination of plasma NGAL with total bilirubin≤600 μmol/L，hemoglobin≤10 g/L，vitamin C≤0.6 g/L and triglyceride≤15 mmol/L.The reagent could be stable for 35 d in the instrument under the condition of 2-8℃.The plasma levels of NGAL in healthy control group were all in manufacturers'reference range.The level of plasma NGALhad been gradually increasing in healthy control group，T2DM group and DN group with statistical significance(P＜0.01).The plasma NGAL were positively correlated with serum cystatin C(Cys C)and creatinine(Cr)(correlation coefficients were 0.58 and 0.43，P＜0.01).ConclusionsThe LEIA for plasma NGAL determination has high sensitivity and precision，which is fast and easy to operate，and can be used directly on the automatic biochemical analyzer.The results are accurate and reliable.It is suitable for the clinical application for mass determination.

Neutrophil gelatinase-associated lipocalin;Latex-enhanced immunoturbidimetric assay;Methodology evaluation

1673-8640(2015)07-0734-06

R

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.016

2014-10-08)

(本文编辑:龚晓霖)

徐州市科技局资助项目(XZZD1348)

孙丽，女，1974年生，学士，副主任技师，主要从事临床生化检验工作。

牛国平，联系电话:0516-83956513。