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氯化镍对真核小鼠胚胎成纤维细胞超氧化物歧化酶2的影响及其机制

2015-01-09王盼盼常文辉骆文静陈景元杜可军第四军医大学劳动与环境卫生教研室陕西西安7002第四军医大学口腔医学系陕西西安7002陕西省疾病预防控制中心西安70054

现代医药卫生 2015年6期
关键词:真核总体磷酸化

王盼盼,常文辉,骆文静,陈景元,杜可军(.第四军医大学劳动与环境卫生教研室,陕西西安7002;2.第四军医大学口腔医学系,陕西西安7002;.陕西省疾病预防控制中心,西安70054)

氯化镍对真核小鼠胚胎成纤维细胞超氧化物歧化酶2的影响及其机制

王盼盼1,2,常文辉3,骆文静1,陈景元1,杜可军1
(1.第四军医大学劳动与环境卫生教研室,陕西西安710032;2.第四军医大学口腔医学系,陕西西安710032;3.陕西省疾病预防控制中心,西安710054)

目的在真核小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)内,进行不同浓度或不同时间的氯化镍(NiCl2)刺激,观察超氧化物歧化酶2(SOD2)的变化,对其可能机制进行探讨。方法培养MEF系,制备NiCl2溶液进行处理,利用Western blotting观察不同浓度或不同时间的NiCl2刺激后SOD2的变化。随后判断其可能的机制。结果不同浓度的NiCl2刺激MEF 12 h后,SOD2的表达总体上有下降趋势,磷酸化蛋白激酶B的表达总体上有上升趋势,而磷酸化信号转导和转录激活子(p-Stat3)的表达总体上有下降趋势;相同浓度的NiCl2刺激MEF不同时间后,SOD2和p-Stat3的表达总体上有下降趋势;p-Stat3与SOD2的总体变化趋势一致。结论SOD2在受到NiCl2的刺激作用后,总体上呈现下降趋势;p-Stat3可能是作为转录因子,在转录水平上进行了SOD2的调控。

镍; 超氧化物歧化酶; 成纤维细胞; 基因表达; 氯化镍

镍作为一种重要的有色金属,广泛存在于多种合金中,被称为“工业维生素”。镍是不锈钢主要合金原料[1]。全球不锈钢产量的迅速增加,直接刺激了镍需求的急速上升。进入21世纪,中国不锈钢的产量达到世界首位,牵动全球不锈钢总产量的走势。目前,国内直接接触镍及其化合物的作业人员数量很多[2]。对环境而言,镍是一种潜在的危害物。环境中镍污染的最大来源是人为活动,包括镍矿及其他重金属矿的开采、冶炼、粉末冶金及相关企业的“三废(废水、废气和废渣)”,化学试剂及其他含镍制品的生产和使用等。镍毒性给人类的健康带来了极大痛苦和损失,国际癌症研究中心已经将镍化合物定义为人类致癌物,所以加大对镍及其相关毒性的防治研究具有重要现实意义。本研究在真核小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)内进行不同浓度或不同时间的氯化镍(NiCl2)刺激,观察超氧化物歧化酶2(SOD2)的变化,对其可能机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 特异性抗体[磷酸化信号转导和转录激活子(p-Stat3,Tyr-705)、p-Stat3(Ser-727)、Stat3、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt,Thr-308)、p-Akt(Ser-473)、Akt]购置于美国Cell Signaling,Beverly,MA公司。特异性抗体SOD2购置于美国Epitomics,Burlingame,CA公司。特异性抗体肌动蛋白β(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)购置于美国Sigma,St.Louis,MO公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MEF的培养主要采用方法参照文献[3]。具体如下:培养采用DMEM培养液加10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mmol/L谷氨酰胺(CA),37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下孵箱培养。待生长至对数生长期时进行传代。

1.2.2 细胞处理 制备NiCl2溶液,在6孔板中采用2 mmol/L的终浓度 NiCl2分别对 MEF进行 0、3、6、9、12、24 h处理;同时采用0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L终浓度NiCl2分别对MEF进行12 h处理。

1.2.3 蛋白质印迹法(Western blotting)处理

1.2.3.1 细胞放置在6孔培养板里进行培养,生长密度达到培养孔面积的85%时收集细胞。收集细胞时培养板置于冰上。细胞首先用4℃的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,然后用裂解液进行处理。裂解液的组成包括10mmol/LTris-HCl、pH=7.4的 1%十二烷基硫酸钠、1 mmol/L Na3VO4及蛋白酶抑制剂,细胞蛋白的提取物参照文献[2]的方法进行处理,先用超声波进行处理,接下来置于100℃下5min进行蛋白变性,用于蛋白电泳。

1.2.3.2 Western blotting检测[4]。裂解后的细胞进行蛋白定量检测。蛋白定量检测试剂盒购置于美国Bio-Rad Lab oratories,Hercules,CA公司。对等量的细胞裂解蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)。接下来蛋白被转移到聚偏二氟乙烯膜上,PVDF膜来源于美国Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA公司。转膜之后封闭,接下来分别加入一抗,进行p-Stat3(Tyr-705)、p-Stat3(Ser-727)、Stat3、p-Akt(Thr-308)、p-Akt(Ser-473)、Akt、SOD2、β-actin、GAPDH等检测;采用碱性磷酸酶标记的二抗,使用增强化学发光法进行Western blotting检测。

2 结 果

2.1 不同浓度NiCl2作用于MEF 12 h后SOD2及p-Akt表达变化 不同浓度的NiCl2(0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L)作用于MEF 12 h后,可观察到SOD2蛋白的表达总体上有下降趋势。同样的NiCl2作用条件下,可以观察到p-Akt蛋白表达无论是在Ser-473位点,还是在Thr-308位点,总体上都有增高趋势。与此同时,可以观察到在不同浓度的NiCl2作用于MEF 12 h后,总Akt蛋白表达量总体上无明显变化。见图1。

图1 不同浓度NiCl2作用于MEF12h后SOD2及p-Akt表达变化

2.2 不同浓度NiCl2作用于MEF 12 h后p-Stat3表达变化 不同浓度的NiCl2(0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L)作用于MEF细胞12 h后,可以观察到p-Stat3蛋白的表达总体上有下降趋势。可以观察到p-Stat3蛋白表达无论是在Ser-727位点,还是在Tyr-705位点,总体上都有降低趋势。与此同时,可以观察到在不同浓度的NiCl2作用于MEF细胞12 h后,Stat3蛋白的表达量总体上无明显变化。见图2。

图2 不同浓度NiCl2作用于MEF 12 h后p-Stat3表达变化

2.3 相同浓度NiCl2作用于MEF不同时间SOD2及p-Stat3表达变化 相同浓度的Nicl2(2 mmol/L)作用于MEF 0、3、6、9、12、24 h后,可以观察到SOD2及p-Stat3蛋白的表达总体上有下降趋势,而且可以观察到p-Stat3蛋白表达无论是在Ser-727位点,还是在Tyr-705位点,总体上都有降低趋势。与此同时,可以观察到在相同浓度的NiCl2作用于MEF不同时间后,Stat3蛋白的表达量总体上无明显变化。见图3。

图3 相同浓度NiCl2作用于MEF不同时间p-Stat3表达变化

3 讨 论

作为一种重要的有色金属,镍及其化合物在工业生产中有广泛应用。但同时镍化合物又被确定为人类致癌物。对镍化合物中毒机制的研究,有利于工业生产开展针对性的职业安全防护。研究表明,镍化合物可以诱导体内产生氧化应激反应,通过产生超氧阴离子自由基损伤细胞,导致机体产生明显的氧化损伤,继而导致机体出现各种损伤,甚至引起细胞发生突变、肿瘤发生等[1]。

机体有一套完整的抗氧化体系,能防止自由基带来的氧化损伤,其中SOD[5]是以超氧阴离子自由基为底物的金属蛋白酶,其可将自由基催化为过氧化物,再在谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶的催化下成为水。SOD作为体内最主要的抗氧化物酶,保护细胞免受损伤,其活力可间接反映机体抗氧化损伤和清除自由基的能力。迄今为止,已发现SOD有3种[6],包括SOD1,又名Cu-Zn SOD,主要存在于真核生物细胞质中;SOD2,又名Mn-SOD,在真核生物及原核生物的线粒体中普遍存在;SOD3,又名Fe-SOD,主要存在于原核生物中。

越来越多的证据表明,SOD2可能作为一种新的肿瘤抑制剂而发挥作用[7]。研究表明,SOD2的活性在超过80种的肿瘤细胞中有所下降[8]。过表达的SOD2将会导致部分肿瘤细胞的抑制[8],SOD2可能与部分肿瘤受到抑制有关[9]。因此,研究SOD2的分子调控机制在肿瘤学及相关研究领域具有非常重要的意义。本研究结果表明,不同浓度NiCl2作用相同时间或相同浓度NiCl2作用不同时间,都能导致SOD2有一定程度下降。本研究结果也表明,导致SOD2下降的同时,可以引起p-Akt表达量的增高。提示p-Akt可能与SOD2的负调控有关。这些与Du等[10]研究结果是一致的。

Akt又称蛋白激酶B,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Akt在细胞的存活和凋亡中起重要作用。多种因子包括胰岛素等生长和存活因子都能激活Akt信号途径。有研究表明,Akt分子通过对FoxO3a等分子的调控,主要是调节Ser-253和Ser-315等位点的磷酸化[11]。Ser-253等位点的磷酸化FoxO3a导致蛋白核定位的改变,最终导致其与调控基因的启动子进行结合,从而实现了对目的基因的调控[12]。

研究表明,镍对SOD的下调可能在蛋白或基因水平都有体现[1],提示这种调控作用有可能发生在转录水平。许多转录因子包括特异性蛋白1(SP1)、激活蛋白1(AP1)、Stats等分子,都在一定程度上参与了SOD2分子的调控[13-14]。本研究结果证明,不同浓度的NiCl2作用于MEF 12 h后或相同浓度的NiCl2作用于MEF不同时间后,SP1、AP1的变化趋势同SOD2的变化并不一致(图片未附),提示在现有作用条件下,SP1和AP1可能并未参与对SOD2在转录水平的调控。而p-Stat3蛋白,无论是在Ser-727位点,还是在Tyr-705位点,表达量总体上都有降低趋势。这些变化趋势,都同SOD2的总体变化趋势基本一致。提示p-Stat3有可能作为转录因子在NiCl2诱导SOD2表达下降的过程中发挥作用。

综上所述,本研究结果表明,在NiCl2作用于MEF后,能够引起MEF内的SOD2表达水平下降,这种下降可能是受到Akt的负调控,并且可能发生在转录水平,Stat3有可能作为一种转录因子在其中起到一种调控作用。本研究发现了NiCl2对SOD2的调控可能是通过p-Stat3进行调控,并且这种调控可能发生在转录水平。本研究为SOD2的进一步探索打下了基础,但更为直接的证据呈现尚有待于进行Stat3与SOD2的免疫共沉淀等研究。

[1]王秋英,王宁,宣小强,等.大鼠急性羰基镍中毒肝脏SOD酶活力及其基因表达的观察[J].工业卫生与职业病,2011,37(4):225-229.

[2]史才财,张兴儒,李轶捷.镍及其化合物对晶状体损伤的研究进展[J].国际眼科杂志,2009,9(3):514-516.

[3]Song L,Li JX,Ye JP,et al.p85alpha acts as a novel signal transducer for mediation of cellular apoptotic response to UV radiation[J].Mol Cell Biol,2007,27(7):2713-2731.

[4]Du K,Chen Y,Dai Z,et al.Molecular cloning and functional characterization of a mouse gene upregulated by lipopolysaccharide treatment reveals alternative splicing[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,391(1):267-271.

[5]Hori YS,Kuno A,Hosoda R,et al.Regulation of FOXOs and p53 by SIRT1 modulators under oxidative stress[J].PLoS One,2013,8(9):e73875.

[6]Chmielewska M,Łosiewicz K,Podlasz P,et al.The expression of mitochondrial,cytoplasmic and extracellular superoxide dismutase in the colonic wall of pigs suffering from swine dysenteria[J].Pol J Vet Sci,2013,16(3):463-467.

[7]Briehl MM,Tome ME,Wilkinson ST,et al.Mitochondria and redox homoeostasis as chemotherapeutic targets[J].Biochem Soc Trans,2014,42(4):939-944.

[8]Xu Y,Fang F,Dhar SK,et al.Mutations in the SOD2 promoter reveal a molecular basis for an activating protein 2-dependent dysregulation of manganese superoxide dismutase expression in cancer cells[J].Mol Cancer Res,2008,6(12):1881-1893.

[9]Weyemi U,Parekh PR,Redon CE,et al.SOD2 defciency promotes aging phenotypes in mouse skin[J].Aqing(Albany NY),2012,4(2):116-118.

[10]Du K,Yu Y,Zhang D,et al.NFκB1(p50)suppresses SOD2 expression by inhibiting FoxO3a transactivation in a miR190/PHLPP1/Akt-dependent axis[J].Mol Biol Cell,2013,24(22):3577-3583.

[11]Hill R,Kalathur R,Callejas S,et al.A novel Phosphatidylinositol 3-Kinase(PI3K)inhibitor directs a potent FOXO-dependent,p53-independent cell cycle arrest phenotype characterized by the differential induction of a subset of FOXO-regulated genes[J].Breast Cancer Res,2014,16(6):482.

[12]Puig-Vilanova E,Rodriguez DA,Lloreta J,et al.Oxidative stress,redox signaling pathways,and autophagy in cachectic muscles of male patients withadvanced COPD and lung cancer[J].Free Radic Biol Med,2014,79C:91-108.

[13]Belton A,Paul A,Duttaroy A.Deletions encompassing the manganese superoxide dismutase gene in the Drosophila melanogaster genome[J].Genome,49(7):746-751.

[14]Liu Z,Gou Y,Zhang H,et al.Estradiol improves cardiovascular function through up-regulation of SOD2 on vascular wall[J].Redox Biol,2014,3:88-99.

Effect with NiCl2 on SOD2 in MEF eukaryotic cells and its mechanisms


Wang Panpan1,2,Chang Wenhui3,Luo Wenjing1,Chen Jingyuan1,Du Kejun1
(1.Department of Occupational and Environmental Health,Fourth Military Medical University,Xi′an,Shaanxi 710032,China;2.Department of Oral Medicine,Fourth Military Medical University,Xi′an,Shaanxi 710032,China;3.Shaanxi Center for Disease Control and Prevention,Xi′an 710054,China)

ObjectiveIn MEF eukaryotic cells,it was stimulated with NiCl2with different concentrations and times.It is investigated the change of SOD2 and its potential mechanisms.MethodsCultivating MEF cells line and preparing Nicl2 solutions,it was observed the change of SOD2 stimulated by NiCl2of different concentrations and times by Western blotting and then judged the potential mechanism.ResultsAfter stimulating MEF for continuous 12 hours with different-concentration NiCl2,the expression of SOD2 was orientated to declining and p-Stat3 and p-Akt rising respectively in general.After stimulating MEF for different time period with the same-concentration NiCl2,the expressions of SOD2 and p-Stat3 were both orientated to decline and rising respectively generally.The overall change of SOD2 and p-Stat3 were in consistent.ConclusionStimulated by NiCl2,SOD2 showed a trend of decline,p-Stat3,probably as the transcription factor,adjusted SOD2 on the transcriptional level.

Nickel; Superoxide dismutase; Fibroblasts; Gene expression; Nickel chloride

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.008

:A

:1009-5519(2015)06-0820-03

2014-10-12)

国家自然科学基金资助项目(30972429);教育部长江学者创新团队计划项目(PCSIRT1112);中国博士后课题资助项目(20060391015)。

王盼盼(1992-),男,陕西西安人,主要从事环境分子毒理学研究;E-mail:cd_novo@hotmail.com。

杜可军(E-mail:dukejun@fmmu.edu.cn)。

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