肿瘤干细胞标志物在鼻咽癌细胞株中的表达

刘观成，何晓松，宣广旭，王文华，陈文文

（1.桂林医学院，广西桂林541004；2.桂林医学院附属医院耳鼻喉头颈外科，广西桂林541001）

肿瘤干细胞标志物在鼻咽癌细胞株中的表达

刘观成1，何晓松2，宣广旭2，王文华2，陈文文1

（1.桂林医学院，广西桂林541004；2.桂林医学院附属医院耳鼻喉头颈外科，广西桂林541001）

目的探索肿瘤干细胞（CSC）标志物ABCG2、CD44、CD34在鼻咽癌细胞株CNE2、5-8F和6-10B中的表达情况，为选择CSC标志物进行鼻咽癌CSC样研究奠定基础。方法常规培养CNE2、5-8F和6-10B这3种鼻咽癌细胞株，用流式细胞仪检测3种鼻咽癌细胞株中ABCG2、CD44、CD34细胞比例及其交互情况。结果ABCG2在CNE2、5-8F和6-10B这3种鼻咽癌细胞株中表达率分别为0.1%、18.6%、19.9%；CD44在CNE2、5-8F和6-10B中表达率分别为99.5%、93.2%、99.1%；CD34在CNE2、5-8F和6-10B中表达率分别为0、3.0%、0.1%。在5-8F中，ABCG2+CD44+细胞交互比例为11.6%，ABCG2+CD34+细胞交互比例为0。结论5-8F和6-10B中CD34+细胞比例与CSC理论中CSC的比例相符。CD34可以作为鼻咽癌CSC的候选标志物。

肿瘤干细胞； 生物学标记； 鼻咽肿瘤/病理学； 细胞系； 表达； 交互作用

鼻咽癌（NPC）是我国南方常见十大恶性肿瘤之一，每年新增患者数达10万例以上，居世界首位。因此，鼻咽癌是中国南方最严重的健康问题之一。在临床治疗中通常以放疗为主并辅以适当化疗，远期预后仍然不良，约55%NPC在治疗后5年出现复发转移[1]。无论是放疗或化疗，都不可避免地给患者带来极大痛苦及不良反应，并且目前的治疗手段已无法大幅度提高患者5年存活率，缺乏对复发及转移的有效控制及复发后耐药性增加是造成这一现象的主要原因。因此，探索防治鼻咽癌的新技术、新方法是十分紧迫的任务。肿瘤干细胞（CSC）理论认为，肿瘤组织中存在一群或多群具有干细胞特性的细胞亚群，即CSC[2-3]。进而认为肿瘤是一种干细胞疾病，这部分细胞具有无限的自我更新及分化潜能；高成瘤性及耐药性是其显著的特性。目前的一些研究认为，这些细胞比率很低，但相对于肿瘤中的其他细胞却表现出更加突出的增殖、分化和侵袭能力，而且明显地耐受辐射及化学治疗。对CSC特性的深入研究，被认为是寻找到克服肿瘤方法的新希望。鼻咽癌CSC研究也逐渐开展，但尚未找到鼻咽癌CSC特征性标记。本研究通过探索CSC标志物ABCG2、CD44、CD34在鼻咽癌细胞株中表达情况，为分离研究鼻咽癌CSC样细胞奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人NPC细胞株CNE2、5-8F、6-10B由桂林医学院实验中心提供。RPMI 1640培养基、0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）、青/链霉素、二甲基亚砜（DMSO，Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），anti-CD34-PE（天津三箭生物技术有限公司），anti-CD44-PE、anti-ABCG2-FITC及其同型（Biolegend公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 分别将鼻咽癌细胞株CNE2、5-8F、6-10B培养在含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培养液中，置于5%CO2、37℃饱和温度的培养箱中培养，每天换液，当细胞生长到铺满培养瓶底80%时行传代培养：先用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，加胰蛋白酶5 mL进行消化，约1 min后加入6 mL含血清的完全培养基终止消化，以1 000 r/min离心5 min，去上清液，加全培养基按1∶2或1∶3传代培养。

1.2.2 流式细胞仪分选 细胞计数约1×106，用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化，PBS洗涤，离心（1 000 r/min）5 min，去上清液，用100 μL PBS重新悬浮，每种细胞实验设置7个检测上样管，分别加入PBS、anti-ABCG2-FITC同型、anti-ABCG2-FITC、anti-CD44-PE同型、anti-CD44-PE、anti-CD34-PE同型、anti-CD34-PE，4℃避光孵育60 min，离心（1 000 r/min）5 min，去上清液，PBS洗涤至少2次，200目细胞网筛过滤，加200 μL PBS重新悬浮细胞，上机检测。

1.2.3 双阳性细胞的检测 对3种CSC标志物均有表达的细胞再次设置5个检测上样管，分别加入PBS、anti-ABCG2-FITC同型和 anti-CD44-PE同型、anti-ABCG2-FITC和 anti-CD44-PE、anti-ABCG2-FITC同型和 anti-CD34-PE同型、anti-ABCG2-FITC和anti-CD34-PE，4℃避光孵育60 min，离心（1 000 r/min）5 min，去上清液，PBS洗涤至少2次，200目细胞网筛过滤，加200 μL PBS重新悬浮细胞，上机检测。

2 结 果

流式细胞仪检测显示，ABCG2在CNE2、5-8F和6-10B这 3种鼻咽癌细胞株中表达率分别为 0.1%、18.6%、19.9%；CD44在CNE2、5-8F和6-10B中表达率分别为99.5%、93.2%、99.1%；CD34在CNE2、5-8F和6-10B中表达率分别为0、3.0%、0.1%；在5-8F中，ABCG2+CD44+细胞交互比例为11.6%，ABCG2+CD34+细胞交互比例为0。见图1。

图1 流式细胞仪检测CSC标志物在鼻咽癌细胞株中的表达

3 讨 论

CSC理论认为，CSC是肿瘤起源细胞，是肿瘤组织的一个亚群，占肿瘤细胞极少数，在肿瘤发生发展、侵袭、转移、耐药、对放疗的抵抗以及复发中起着至关重要作用。CSC具有其特有的生物学特性，主要如下：（1）具有肿瘤细胞再生能力并促成肿瘤的异质性[4-5]；（2）具有多重耐药性和对射线抗性[6-7]；（3）具有很强的侵袭转移能力[8]；（4）拥有与CSC相关信号传导通路[9]；（5）表达与正常细胞、肿瘤细胞和CSC相关分子标志，如CD133是一种细胞膜表面蛋白，表达于正常细胞、肿瘤细胞和CSC，可作为某些CSC的特征性表面标志，利用其结合流式细胞仪等技术可以分选出特异性CSC[10]。

获取CSC是进行CSC研究的前提。CSC的分选主要基于CSC生物特性。常用方法如下：（1）根据CSC特征性表面标记，CSC表达的特征性表面标记，是区分CSC和非CSC最准确的标志。利用CSC特征性表面标记结合免疫磁珠、流式细胞仪等技术，可以分离出高纯度CSC；（2）根据CSC离体培养特性；（3）根据侧群细胞特性；（4）利用（LRC）技术。

ABCG2基因编码多耐药转运蛋白，所以又称为多药耐药转运蛋白（MDRP）基因。该蛋白可以将细胞内药物或有害代谢物质转运到细胞外，从而维持细胞正常功能，在恶性肿瘤的多药耐药方面起重要作用[11]。而多耐药性是CSC的一个重要特性，在放化疗抵抗中起着重要作用，因此其可能是CSC重要标记物。在一些实体肿瘤中，ABCG2+肿瘤细胞不仅耐放化疗，而且具有很强的增殖、侵袭、转移能力，这与CSC的特性相似。

CD44是黏附因子家族中一员，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间黏附作用的膜表面糖蛋白，参与细胞的增殖、分化、黏附、迁移等过程，CD44分子还可作为多种实体CSC的表面标志。

人CD34基因定位于clql2-qter上，与CIM5及一些膜蛋白家族成员相毗邻。CD34 cDNA长2.7 kb，由1个长的开放阅读框构成，编码373氨基酸残基多肽链。CD34基因产物CD34抗原为一个相对分子质量为105×103～120×103的跨膜细胞表面糖蛋白。在急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病患者中确定CSC的第1个筛选标志就是CD34分子。Fiegel等[12]通过免疫组织化学证实，人儿童肝母细胞瘤中的CSC样特征性表面标记是CD34+THY1+C-kit+。刘丹等[13]研究发现，肺癌的CSC标志物为CD133+、CD34+、CD44+。

目前，鼻咽癌CSC研究取得初步进展[14]，已经发现多种CSC表面标志物及干性基因在鼻咽癌中表达并分选出一些细胞亚群，这些亚群虽有CSC的一些特性，但仍不是鼻咽癌CSC。因为检验CSC的“金标准”为裸鼠体内成瘤能力，目前鼻咽癌CSC裸鼠体内的成瘤能力最强的为Wang等[15]分离的ABCG2+细胞，用2×103ABCG2+鼻咽癌细胞便可成瘤，较未分离鼻咽癌细胞成瘤能力强50倍，但这些与白血病CSC、乳腺癌CSC 100个就能成瘤相差甚远。因此，寻找鼻咽癌CSC特异性表面标记物，探索有效分离、鉴定鼻咽癌CSC方法是目前鼻咽癌CSC研究的迫切任务之一。

本研究结果显示，不同CSC标志物在不同鼻咽癌细胞中表达有差异，这可能由不同标志物的功能及细胞本身的特性所决定，如5-8F细胞比其他鼻咽癌细胞成瘤、侵袭、耐药等能力均较强，因此耐药基因ABCG2及血管生成基因CD34在5-8F中的表达较高。或许这也正是目前鼻咽癌CSC的研究较集中于5-8F的原因之一。鼻咽癌种类较多，因此不同CSC标志物在不同鼻咽癌中的表达是否不同及不同种鼻咽癌细胞是否拥有共同的标志物是值得探究的问题。本研究结果发现，CD44在CNE2、5-8F和6-10B这3种鼻咽癌细胞株中普遍高表达，其结果与庄慧文[16]检测的CD44在CNE2中高表达相符合。本研究ABCG2在5-8F和6-10B中等水平表达，在CNE2中低表达；CD34在CNE2、5-8F和6-10B中普遍低表达；在5-8F中，ABCG2与CD44之间存在交互作用，但ABCG2与CD34之间无交互作用。5-8F和6-10B中CD34+细胞比例与CSC理论中CSC的比例相符。CD34可以作为鼻咽癌CSC研究的候选标志物。以往对鼻咽癌CD34基因的研究集中在探索该基因功能，而不是把CD34分子作为细胞表面标志，从而分离研究鼻咽癌中CD34+亚群生物特性及其与普通鼻咽癌细胞之间有无差异。本研究为一前期实验，意在探索不同CSC标记物在鼻咽癌不同细胞株中的表达情况以及流式细胞仪分选CSC样细胞的可靠性，为后续鼻咽癌CSC研究奠定基础，但尚未阐明鼻咽癌中CD34+亚群的生物特性及其与普通鼻咽癌细胞之间有无差异，需要进一步实验去证实。

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The expression of cancer stem cell markers in human nasopharyngeal carcinoma cell lines

Liu Guancheng1，He Xiaosong2，Xuan Guangxu2，Wang Wenhua2，Chen Wenwen1
（1.Guilin Medical Hospital，Guilin，Guangxi 541004，China；2.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，the Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin，Guangxi 541001，China）

ObjectiveTo explore the expression of cancer stem cells（CSC）markers named ABCG2，CD44，CD34 in hu man nasopharyngeal carcinoma（NPC）CNE-2，5-8F and 6-10B cell lines to provide the basis of CSC markers research of NPC.MethodsThe NPC cell lines of CNE2，5-8F and 6-10B were cultivated regularly，of which，ABCG2，CD44，CD34 cell ratio was detected with flow cytometry.ResultsABCG2 positive cells accounted about 0.1%，18.6%and 19.9%in the CNE-2，5-8F，6-10B cell lines.CD44 positive cells accounted 99.5%，93.2%and 99.1%in the CNE-2，5-8F and 6-10B cell lines.CD34 positive cells accounted 0，3.0%and 0.1%in the CNE2，5-8F，and 6-10B cell lines.ABCG2+CD44+cell interation accounted about 11.6% and ABCG2+CD44+cell interation accounted about 0 in 5-8F cell lines.ConclusionThe expression proportion of CD34+in the 5-8F and 6-10B cell lines confirms to CSC markers of the CSC theory.CD34 may be deemed as a candidate marker of nasopharyngeal neoplas.

Neoplastic stem cells； Biological markers； Nasopharyngeal neoplasms/pathology； Cell line； Express； Interaction

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.001

A

1009-5519（2015）06-0801-03

2014-10-14）

刘观成（1986-），男，安徽安庆人，在读硕士研究生，主要从事头颈肿瘤的研究；E-mail：362732615@qq.com。

何晓松（E-mail：hexiaosonggx@sina.com）。