重度畸形精子症患者精核蛋白表达的研究

葛 斌，杨智敏，路 健，杨名慧

（遵义医学院附属医院生殖中心，贵州遵义563003）

重度畸形精子症患者精核蛋白表达的研究

葛 斌，杨智敏，路 健，杨名慧

（遵义医学院附属医院生殖中心，贵州遵义563003）

目的研究重度畸形精子症患者精核蛋白（TNBP）含量及表达差异，为临床治疗提供理论基础。方法2013年2月至2014年5月提取23例重度畸形精子症患者（重度畸精组）和37例健康男性（对照组）的精液TNBP，在聚丙酰胺凝胶中电泳，经微显像测密仪扫描以测定各蛋白条带的相对含量。结果重度畸精组总组蛋白/总碱性蛋白（TH/TP）、1型精核蛋白/2型精核蛋白（TNBP1/TNBP2）、TP/TNBP2值显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而TNBP1/ TP值与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；精子密度显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；精液活率、前向运动率与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论TNBP的相对含量中TNBP1/TNBP2和TP/TNBP2比值异常是导致重度畸精症的原因之一。

精子； 先天畸形； 基因表达； 重度畸精症； 精核蛋白

目前，男性不育发病率呈上升趋势，近20年来人类精子数量平均每年以2%的速度下降。不育不仅影响患者的身心健康，而且还会带来一些社会问题，因此，男性不育症的研究已经引起全世界的高度重视[1]。最近研究发现，精子组蛋白-精核蛋白取代反应（HPRR）和精核蛋白（TNBP）的表达异常与男性不育有密切关系[2]。精子总碱性核蛋白，即TNBP有2种亚型：1型精核蛋白（TNBP1）和2型精核蛋白（TNBP2），所有哺乳动物精子内均有TNBP1，而TNBP2仅存在于人类、马和小鼠等少数哺乳动物体内。TNBP2的表达量与人类睾丸内精子数量密切相关[2]，也有学者认为，TNBP1/TNBP2值相对于TNBP总量更能反映出人类精子质量[3]。

畸形精子症（畸精症）是引起男性不育的主要原因之一，指正常形态的精子数占总精子数的比例小于4%，而小于1%为重度畸精症。重度畸精症的病因很复杂，其中染色体异常和DNA损伤是导致畸精症的主要原因之一[4]，最近黄茜等[5]研究发现，畸精症患者DNA完整性显著高于健康者。Harbuz等[6]认为，TNBP1基因SNP位点-190c-＞A多态性是引起重度畸精症的重要原因之一，该位点多态性通过调节TNBP1的表达量来影响畸形精子的比例[7]。本研究以此为切入点，探讨TNTP表达差异与重度畸精症的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年2月至2014年5月到本中心男科实验室行精液质量分析的患者23例，均为原发不育1年以上的重度畸精症患者（重度畸精组），平均年龄（33.2±4.7）岁，正常形态精子小于1%，排除染色体异常、精索静脉曲张等疾病。另选取有健康生育史男性37例为对照组，平均年龄（31.7±5.2）岁，正常形态精子大于或等于4%。

1.2 方法 两组研究对象禁欲2～7 d，用手淫方法取出精液至广口杯内，于37℃恒温水浴箱内液化30 min。使用伟力全自动精子分析软件测定精液密度、活率和前向运动精子率，形态检查使用德国WALDECK公司生产的Testsimplets染色玻片，染色后于油镜下计数200个精子，计算出畸精率，各参数均参照WHO男科学诊断标准。

1.2.1 提取TNBP 用高低密度洗涤液洗涤精子，离心（2 000 r/min）10 min，并调整精子密度为20×106mL-1，精液样本用生理盐水洗涤2次后离心（1 800 r/min）5 min，将精子沉淀溶于少量5 mol/L盐酸胍溶液，使核解聚，随后加入1 mol/L盐酸溶液至终浓度为0.25 mol/L，冰浴20 min后离心（1 000 r/min）15 min，分离上清液。沉淀物再用0.25 mol/L盐酸溶液重复抽提1次，合并2次上清液。在上清液内加入60%三氯醋酸，使终浓度为20%，冰浴25 min后离心（1 000 r/min）15 min，沉淀物用冷丙酮洗涤后离心（1 000 r/min）15 min，最后将提取的TNBP真空干燥。

1.2.2 总碱性蛋白（TP）及蛋白含量测定 在TP的丙酮干粉中加入0.2 mL蛋白溶解液、60%三氯乙酸，混合后冰浴20 min，在400 nm处比色后计算TP含量。TP中各蛋白含量测定采用Panylm-Chalkley法在聚丙酰胺凝胶中电泳，电泳胶用0.1%氨基黑染色脱色后拍摄成照片，用扫描仪扫描各蛋白条带，测定各蛋白含量，用总组蛋白（TH）/TP和TNBP1/TNBP2值表示TNBP的相对含量。

1.2.3 观察指标 观察记录两组研究对象TNBP相对含量（TH/TP、TNBP1/TNBP2、TP/TNBP2、TNBP1/TP平均值）及精液质量参数（精子密度、活率、前向运动率）。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组研究对象TNBP相对含量比较 重度畸精组患者TH/TP、TNBP1/TNBP2、TP/TNBP2平均值明显较对照组高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而TNBP1/TP平均值与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 两组研究对象精液质量参数比较 对照组研究对象的平均精子密度明显高于重度畸精组，差异有统计学意义（P＞0.05）；而精子活率、前向运动率与重度畸精组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 两组研究对象TNBP相对含量比较（±s）

表1 两组研究对象TNBP相对含量比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05。

组别对照组重度畸精组n TH/TP TNBP1/TNBP2 TP/TNBP2 TNBP1/TP 37 23 0.20±0.04 2.92±1.57a0.93±0.10 2.26±0.96a2.25±0.41 4.64±1.93a0.25±0.06 0.28±0.03

表2 两组研究对象精液质量参数比较（±s）

表2 两组研究对象精液质量参数比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05。

组别对照组重度畸精组n 精子密度（×106mL-1） 活率（%） 前向运动率（%）66.83±14.26 8.29±2.91a37 23 55.22±19.87 60.16±21.43 45.43±17.69 47.35±16.51

3 讨 论

精子形态受多种因素影响，精液白细胞、重金属和微量元素浓度增加、空气污染、工作环境、卵泡生成激素水平和基因突变均可能导致畸精症[8-10]。精液中白细胞释放的活性氧等活性产物可介导精子膜脂质过氧化，破坏精子内部结构；工作环境对精液形态也有明显影响，本中心以往研究发现，从事电焊、装修和酿酒等职业者精子正常形态率显著下降，尾部卷曲精子率明显升高；基因异常也是引起重度畸精症的主要原因之一，目前发现的重度畸精症相关基因有透明带结合蛋白基因、精子成熟蛋白基因、过度蛋白基因和TNBP基因等[5]。精子形态异常包括头部异常、颈部异常、尾部异常和细胞质小滴等，以头部异常最为常见，表现形式为梨形头、不定形头和顶体缺失等，畸形精子经常出现顶体与核膜分离、双层膜结构部分或全部消失、顶体反转等现象，所以当精子形态异常时，就会影响到精子表面的糖基结合蛋白的结构，精子附着于卵细胞透明带能力下降，使精子与卵子的顶体-透明带反应发生障碍，从而精子无法穿透卵子透明带和质膜与卵子结合受精[11]。

人类精子细胞发育过程中，TNBP逐渐取代组蛋白与DNA结合构成精子染色质，这一现象称为HPRR，因此，TNBP是成熟精子内TP的主要组成部分，TNBP相对于TH更容易与DNA结合，它使细胞核高度浓缩，促进精子细胞由圆形变成长形，最终分化为成熟精子，对维持精子细胞核稳定有重要意义[12]，因此TNBP表达差异直接影响男性生育能力。TNBP2仅存在与人类等极少数哺乳动物中，研究发现，TNBP2的表达量和TNBP2/ TNBP1值与精子密度、活率密切相关[2]。本研究结果发现，重度畸精组患者TNBP表达总量明显高于对照组，说明该类型患者存在HPRR障碍，而TNBP1/TNBP2值稍高于对照组，显示TNBP表达量的下降主要表现为TNBP2表达量的减低。由此可知，TNBP表达差异与精子形态异常存在相关性。

少精症、弱精症和畸精症是男性不育的主要表现形式，这3种情况经常在单个个体中同时发生，作者以前的研究也证实了这一点[13]。本次研究结果发现，重度畸精组患者的精子密度显著低于对照组，但是活率和前向运动率与对照组无明显差异，这与作者以前的研究结果[13]不同，分析原因应该是样本量较少所致（上次样本总量为386例，此次仅为60例）。

目前，治疗重度畸精症的主要方法是卵胞浆内单精子注射，此方法不但成本昂贵且增加了遗传病垂直传递给子代的风险，因此，寻找安全、有效、成本低的方法治疗重度畸精症已成为最近比较热门的研究。有学者采用中成药治疗男性少、弱、畸精症已初见成效[10]。本研究初步探讨了重度畸精症患者TNBP的表达差异，有望对重度畸精症的临床治疗提供理论基础。

[1]Okada H，Tajima A，Shichiri K，et al.Genome-wide expression of azoospermia testes demonstrates a specific profile and implicates ART3 in genetic susceptibility[J].PLoS Genet，2008，4（2）：e26.

[2]王旭初.男性不育与精核蛋白的关系及中西医治疗进展[J].光明中医，2012，27（12）：2614-2616.

[3]王旭初，潘天明.少弱精症与精核蛋白的关系研究进展[J].现代中西医结合杂志，2010，19（33）：4358-4360.

[4]杨雪，王碧，吴忠琴，等.163例少、弱精子症和畸形精子症及无精子症患者的染色体分析[J].中国优生与遗传杂志，2012，20（10）：49.

[5]黄茜，丘映，史秋雯，等.精子DNA损伤与精子形态、顶体完整率的关系研究[J].国际检验医学杂志，2013，34（6）：649-650.

[6]Harbuz R，Zouari R，Pierre V，et al.A recurrent deletion of DPY19L2 causes infertility in man by blocking sperm head elongation and acrosome formation[J].Am J Hum Genet，2011，88（3）：351-361.

[7]余庆锋，杨学习，李粉霞，等.PRM1基因SNP位点-190C-＞A多态性对精子畸形率的影响[J].中华男科学杂志，2012，18（4）：314-317.

[8]Brahem S，Mehdi M，Elghezal H，et al.Detection of DNA frag mentation and meiotic segregation in human with isolatedteratozoospermia[J].J Assist Reprod Genet，2011，28（1）：41-48.

[9]刘富新，苏大林，郝爱军，等.精浆各微量元素含量对精子形态的影响[J].国际检验医学杂志，2012，33（8）：912-913.

[10]徐潘，陈盛镱，谢作刚.畸形精子症研究进展[J].浙江中西医结合杂志，2014，24（5）：474-476.

[11]潘家坪，陈智勤，王羽，等.精子形态与体外受精中受精率的关系[J].诊断学理论与实践，2012，11（3）：249-251.

[12]陈松，曹坚，费仁仁，等.弱精子症患者精核蛋白含量的分析[J].中华男科学杂志，2005，11（8）：587-589.

[13]葛斌，谭兵兵，谭晓珊，等.精子形态与精子活力活率的关系[J].现代医药卫生，2008，24（21）：3176-3177.

Protamine expression in severe teratozoospermia patients

Ge Bin，Yang Zhimin，Lu Jian，Yang Minghui
（Reproductive Center，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou，Zunyi 563003，China）

ObjectiveTo investigate the difference of content and expression of protamine（TNBP）in the severe teratozoospermia patients and provide the theoretical basis.MethodsIt was extracted TNBP of semen protamine from 23 severe teratozoospermia patients（the severe teratozoospermia group）and 37 healthy men（the control group）from Feruary 2013 to May 2014 with polyacrylamide gelelectrophoresis and then confirm the relative content of proein bands scanned by micro imaging density measuring instrument under the cataphoresis in the polyacrylamide hydrogel.ResultsThe value of TH/TP，TNBP1/TNBP2，TP/ TNBP2 in the evere teratozoospermia group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.Compared with the control group，there was no significant difference in TNBP1/TP value（P＞0.05）.Thesperm density was lower than that of the control group（P＜0.05）.Both the sperm survival rate and the precession movement rate showed no significant difference with the control group（P＞0.05）.ConclusionThe abnormity of TNBP1/TNBP2，TP/TNBP2 in the relative content of TNBP is one of the reasons leading to severe teratozoospermia.

Spermatozoa； Congenital abnormalities； Gene expression； Severe abnormal azoospermia； Protamine

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.007

：A

：1009-5519（2015）06-0818-02

2014-10-29）

遵义医学院硕士启动基金（院字2007-54号）。

葛斌（1981-），男，安徽涡阳人，硕士研究生，主要从事分子遗传学方面的研究；E-mail：38248866@qq.com。