冰冻切片技术在神经病理诊断中的应用

刘朝霞，徐 丽，王军梅，杜 江，李桂林（首都医科大学附属北京天坛医院神经外科研究所，北京100050）

冰冻切片技术在神经病理诊断中的应用

刘朝霞，徐 丽，王军梅，杜 江，李桂林
（首都医科大学附属北京天坛医院神经外科研究所，北京100050）

目的探讨改进术中冰冻切片质量的技巧和方法，以利于提高冰冻切片的染色效果，提高冰冻切片病理诊断的准确率。方法对2011年1月至2014年8月首都医科大学附属北京天坛医院神经外科手术切除的3 000例新鲜脑肿瘤标本进行取材、冰冻、切片、染色，制作冰冻切片。其中神经上皮组织肿瘤2 103例，神经肿瘤102例，脑膜肿瘤388例，淋巴造血系统肿瘤23例，生殖细胞肿瘤79例，鞍区肿瘤129例，转移性肿瘤79例，其他肿瘤97例，对上述肿瘤的冰冻切片进行回顾性分析，改进染色方法，观察染色效果，分析诊断准确率。结果3 000例脑肿瘤标本的冰冻切片染色效果良好，组织结构完整，细胞形态清晰，一般制片过程约需10 min。术后与石蜡切片诊断对照，其中神经上皮组织肿瘤2 078例，神经肿瘤101例，脑膜肿瘤378例，淋巴造血系统肿瘤22例，生殖细胞肿瘤75例，鞍区肿瘤127例，转移性肿瘤76例，其他肿瘤86例，诊断符合率为98.1%，未发现良、恶性质相反的诊断。结论改进冰冻切片的染色方法，可提高冰冻切片的染色质量，提高病理诊断的准确率。

冷冻超薄切片术； 染色与标记； 神经系统/病理学； 病理诊断

冰冻切片是利用低温条件，使组织迅速冻结达到一定硬度并进行切片的一种方法。术中冰冻诊断是病理科非常重要的一项工作，要求快速、准确。冰冻切片质量的好坏，直接影响病理诊断的速度和质量。由于冰冻切片受到组织冷冻温度、冷冻时间、组织含水量等因素的影响，在实际工作中会遇到一些问题，如冰晶形成、切片皱褶、切片脱落、染色欠佳等。这就要求病理技术人员熟练掌握冰冻切片技术，并不断总结经验，以便快速切出精良的冰冻切片，为病理医生诊断提供可靠保证。作者在实际工作中，经过多次实验，对染色方法[1]进行改进，达到了满意的染色效果，并对3 000例神经系统肿瘤的冰冻切片诊断结果进行分析。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 对2011年1月至2014年8月首都医科大学附属北京天坛医院神经外科手术切除的新鲜脑肿瘤标本3 000例进行回顾性研究总结。3 000例脑肿瘤患者中男1 743例，女1 257例；年龄1～82岁，平均29.4岁；神经上皮组织肿瘤2 103例，神经肿瘤102例，脑膜肿瘤388例，淋巴造血系统肿瘤23例，生殖细胞肿瘤79例，鞍区肿瘤129例，转移性肿瘤79例，其他肿瘤97例。所有脑肿瘤标本均为术中新鲜切除，加入生理盐水并立即送检，制作冰冻切片。

1.1.2 设备与试剂 德国产LEICA CMl950型恒冷切片机、德国产LEICAHI1220烤片机、液氮、加拿大树胶等；将Harris苏木素染液、1%盐酸乙醇溶液、水溶性伊红染液、95%乙醇、80%乙醇、二甲苯盛于染色缸中备用。

1.2 方法

1.2.1 取材 将手术中送检的组织按常规取材。脑肿瘤标本多数较小，应全取。较大的标本应选取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm组织块。取材时应避开坏死出血区，剔除毛发、硬骨及钙化点，尽量使标本干燥。

1.2.2 冰冻 用滴管在冷冻托盘上滴加一滴自来水，将冷冻托盘置于液氮中，约10 s后取出，用自来水凝结成冰，将新鲜标本放在冰面上，确定标本与冰面黏结牢固后，将冷冻托盘再次置于液氮中，约10 s后取出，观察新鲜标本是否冷冻到合适硬度。可根据标本大小及性质调节冷冻时间。

1.2.3 切片 切片时手摇轮用力要均匀，转速以8～ 10 r/min为宜。刀速缓慢均匀，厚度4～6 μm，根据切片大小，每切一片选择预先放在冷冻箱内合适的毛笔压切片前缘使其不卷曲，展平后及时附贴于载玻片上。将载玻片放在烤片机上烘烤5s（烤片机温度预设为56℃），然后置于95%乙醇中浸泡5 s进行固定。

1.2.4 染色 将已固定的切片滴加Harris苏木素染液，染液要覆盖整个组织，置于烤片机上烘烤2 min，水洗，用1%盐酸乙醇分化10 s，水洗返蓝1 min，滴加水溶性伊红染液10 s，水洗，95%乙醇浸泡30 s，80%乙醇浸泡30s，二甲苯浸泡30 s，加拿大树胶封片。

2 结 果

2.1 染色效果 3 000例切片效果良好，切片完整，厚薄均匀、无皱折，镜下组织结构完整、细胞形态清晰，细胞核呈蓝色，细胞质呈淡粉色，细胞间质及血管呈粉红色，细胞质与细胞核红蓝对比鲜明，细胞无肿胀及皱缩、空泡，无冰晶形成。组织结构能较完整地呈现，分辨率良好，见图1～4。一般制片过程约需10 min。

图1 星形细胞瘤冰冻切片（HE染色，200×）

图2 脑膜肿瘤冰冻切片（HE染色，200×）

图3 神经鞘瘤冰冻切片（HE染色，200×）

图4 髓母细胞瘤冰冻切片（HE染色，200×）

2.2 诊断符合率 在3 000例冰冻切片中，有2 943例报告为明确诊断，并在石蜡切片诊断过程中得到证实，其中神经上皮组织肿瘤2 078例，神经肿瘤101例，脑膜肿瘤378例，淋巴造血系统肿瘤22例，生殖细胞肿瘤75例，鞍区肿瘤127例，转移性肿瘤76例，其他肿瘤86例，术后诊断符合率为98.1%。有57例未作出明确诊断，以镜下所见形态进行描述的方法报告。在冰冻切片诊断与石蜡切片诊断对照的过程中，未发现良、恶性质相反的诊断。3 000例脑肿瘤冰冻切片与石蜡切片诊断符合情况见表1。

表1 3 000例脑肿瘤冰冻切片与石蜡切片诊断符合情况

3 讨 论

冰冻切片病理诊断是手术过程中确定疾病性质、指导临床医生在手术过程中决定手术方案的一种快速而可靠的手段[2]。1818年Fleter de ffiemer首创冰冻切片技术，1891年Halsted和Aceop将冰冻切片技术列为正式诊断方法。其原理是利用低温冷冻技术使待检组织变硬，以代替石蜡包埋，进行组织制片的一种方法[3]。制片的好与坏，直接影响着临床病理诊断效果。

正确取材在术中冰冻切片诊断中至关重要。组织块适宜大小为1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，组织块过大，易影响制片质量，造成切片皱折、形成刀痕等。脑肿瘤多数送检标本较小，应全取，并剔除毛发、硬骨及钙化。在取材时尽量使标本干燥，若标本混有水分，切片时由于冰和标本的硬度不同，易致切片皱折，无法展开，导致切片困难。

冷冻温度和时间是冰冻切片制作过程中的重要环节，直接影响冰冻切片的质量。一般恒温冰冻切片机的工作室温度控制在-24～-20℃，不同组织的冷冻温度和时间要求不同，时间为数分钟不等[4-6]。本研究采用液氮冷冻的方法，可使组织迅速冷冻，缩短冷冻时间，更有效地防止冰晶形成。本研究3 000例脑肿瘤冰冻切片中无一例出现冰晶。多数实验包埋时选用进口包埋剂最佳切削温度的化合物（OCT）或普通胶水[7-8]，本研究采用直接将标本置于冰面上的方法，节省实验成本，减少实验步骤，缩短制片时间。在冷冻托盘上制作冰面时，冷冻时间要适宜，时间过长易导致冰面过分干燥，时间过短易致冰面水分剩余过多，二者均可造成标本黏固不牢，滑落液氮中。将新鲜标本放在冰面上，必须确定标本与冰面黏结牢固后，再置于液氮中，这样可有效防止标本滑落液氮中。若标本较大或质地较韧，与冰面黏固不牢，可在标本底部加一滴水进行冷冻。标本冷冻时间不宜过长，时间过长会使组织过硬，切片时易呈碎屑，可在切出完整平面后用戴手套的拇指按压或在组织切面上哈气回温，使组织变软后再切。标本为数块碎组织时，应尽量将标本置于同一平面，以利于切片完整。

切片时适宜厚度为4～6 μm，可根据切片大小，每切一片选择预先放在冷冻箱内合适的毛笔压切片前缘使其不卷曲，展平后及时附贴于载玻片上。切片时注意事项：切片时应充分暴露组织最大切面，带有包膜的组织须切出包膜，以便观察肿物是否浸润。但切片时也必须注意观察重点病变的微小病灶，避免修切过度，造成漏诊[9]。载玻片可选用经防脱APES处理后的载玻片。若无防脱胶玻片，可用普通载玻片进行黏附，然后将载玻片放入恒温干燥箱内底板上，此时要使黏有组织的一面朝上，烤片10 s后拿出在室温中稍加冷却后放入AAF固定液中进行固定及染色，此时组织便可牢牢地黏在载玻片上[10]。也有学者将载玻片用1%盐酸溶液浸泡0.5 h，捞出用清水冲洗干净再用95%乙醇浸泡10 min，蒸馏水洗净，烤干后备用[11]。在选择固定液时，有研究表明，在10%甲醛、95%乙醇、AAF固定液、丙酮、甲醇和乙醚乙醇（乙醚∶乙醇1∶1）6种固定液中，乙醚乙醇（乙醚∶乙醇1∶1）固定液较其他5种固定液的制片效果更好[12]。通常使用普通载玻片，将组织黏附在载玻片后，放在烤片机上烘烤5 s，然后置于95%乙醇中浸泡5 s进行固定，防脱片效果良好，未发生过脱片现象。

染色过程中需掌握好每一步所需时间，并尽量振动切片，使组织与固定液、染色液、脱水液充分融合，加快染色速度，提高染色质量。在染色时用烤片机加热切片，以加快染色速度，并且染色步骤较少，也缩短了染色时间，整个制片过程约需10 min。

本研究结果显示，3 000例冰冻切片染色效果良好，切片完整，厚薄均匀、无皱折，镜下组织结构完整、细胞形态清晰。术后诊断符合率为98.1%。未发现良、恶性质相反的诊断。

总之，制作冰冻切片是一项重要的病理实验技术，在取材、冰冻、切片及染色的每一个环节中都必须充分掌握其技术要领，控制好各个操作环节，并且要求操作人员具有一丝不苟的工作态度和责任心，才能制作出优质的冰冻切片。

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读者·作者·编者

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本刊编辑部

The application of frozen sections technique in diagnosis of neuropathology

Liu Zhaoxia，Xu Li，Wang Junmei，Du Jiang，Li Guilin
（Beijing institute of neurosurgery of Capital Medicial University，Beijing 100050，China）

ObjectiveTo explore and improve the skills and methods of the quality of frozen sections in order to improve the staining effect of frozen sections and raise the rate of correct diagnosis.MethodsA total of 3 000 cases of fresh brain tumors specimens underwent neurosurgical operations in Beijing Tian Tan Hospitalof Capital Medical University from January 2011 to August 2014 were drawn，frozen，sliced and stained successively，including 2 103 with neuroepithelial tumors，102 with nervous tumors，388 with meningeal tumors，23 with lymphohematopoietic tumors，79 with germ cell tumors，129 with sellar tumors，79 with metastatic tumors and 97 with other tumors.A retrospective analysis of the aboved frozen sections was made to improve the staining assay，observe the staining effect and analyze the accuracy rate of diagnosis.ResultsThe frozen sections of all the brain tumors samples in this study were perfectly stained with intact organizational structures and clear cell morphologies.Dyeing process takes about ten minutes.With a comparison of the diagnosis of paraffin sections after the surgery，it showed 2 078 with neuroepithelial tumors，101 with nervous tumors，378 with meningeal tumors，22 with lymphohematopoietic tumors，75 with germ cell tumors，127 with sellar tumors，76 with metastatic tumors and 86 with other tumors.accounting for 98.1%in diagosis accuracy. There were no contrary diagnosis involving in benign and malignant neoplasias.ConclusionImproving the staining assay of frozen sections may improve the staining quality of frozen sections and the rate of correct diagnosis.

Cryoultramicrotomy； Staining and labeling； Nervous system/pathology； Pathology diagnosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.006

：A

：1009-5519（2015）06-0815-03

2014-11-06）

刘朝霞（1969-），女，北京东城人，主管技师，主要从事脑肿瘤的病理学及分子病理学研究；E-mail：liuzhaoxia69@sina.com。

李桂林（E-mail：liguilin2010@sina.com）。